利多卡因调控微小RNA-195对骨肉瘤MG63细胞增殖、凋亡及化疗敏感性的影响

孙贺，李展

骨肉瘤是发生于骨组织的恶性肿瘤，其具有恶性程度高及早期转移等特点，早期化疗对控制疾病进展具有重要意义，但部分患者易产生化疗耐药性从而降低治疗效果［1-2］。目前关于骨肉瘤细胞化疗抵抗产生机制尚未完全阐明，研究表明骨肉瘤患者围手术期应用的麻醉药物对癌细胞增殖、迁移等具有重要调控作用［3］。研究表明利多卡因（lidocaine）可诱导结肠癌细胞周期停滞，抑制细胞生长［4］。利多卡因还可抑制乳腺癌细胞转移［5］。但利多卡因对骨肉瘤细胞的研究尚未可知。近来研究报道指出miRNA 可调节肿瘤细胞增殖、凋亡等生物学行为，以miRNA 为靶点可作为化疗干预的重要手段，其中miR-195 在乳腺癌细胞中表达降低，并可增强细胞化疗敏感性［6］。miR-195 可靶向调控RAF1 表达抑制口腔鳞状细胞癌细胞发展［7］。关于miR-195 对骨肉瘤细胞生物学行为及化疗敏感性的研究尚未见报道。本研究于2018年5—12月探究利多卡因是否可通过调控miR-195 影响骨肉瘤细胞增殖、凋亡及化疗敏感性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂利多卡因购自宜昌人福药业公司；骨肉瘤MG63细胞购自美国ATCC公司。胎牛血清与RPMI 1640 培养基均购自美国Gibco 公司；Trizol、SYBR Green 核酸荧光染料、反转录试剂盒均购自日本TaKaRa 公司；MTT 与二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量检测试剂盒均购自美国Sigma 公司；细胞凋亡试剂盒购自大连美仑生物公司；cyclinD1、Cleaved Caspase-3 抗体均购自美国Abcam 公司；山羊抗兔IgG 抗体购自上海碧云天生物技术有限公司；Lipofectamine2000 购自Thermo Scientific 公司；miR-195 模拟物（miR-195 mimics）、阴性对照mimic NC 序列（miR-con）、阴性对照序列（anti-miRcon）、miR-195 抑制物（anti-miR-195）均购自山东维真生物公司。

1.2 方法

1.2.1 实验处理与分组 RPMI 1640 培养基+10%

胎牛血清培养骨肉瘤MG63 细胞，于37 ℃、5%二氧化碳饱和湿度培养箱内培养。收集对数生长期MG63 细胞，利多卡因（0、2、4、8、16 mmol/L）处理细胞，分为0 mmol/L 组、2 mmol/L 组、4 mmol/L 组、8 mmol/L组、16 mmol/L组，各组分别处理24、48、72 h。经MTT筛选适宜利多卡因适宜浓度进行后续研究。

MG63 细胞分别转染miR-195 mimics、miR-con，分别命名为miR-195组、miR-con组，未经任何处理的细胞作为NC组，各组处理时间24 h。后续实验中将anti-miR-195、anti-miR-con分别转染入MG63细胞后，用含有4 mmol/L的利多卡因处理48 h，分别命名为lidocaine+anti-miR-195组、lidocaine+anti-miR-con组。

1.2.2 甲基噻唑基四唑（MTT）检测细胞增殖取对

数生长期细胞，接种于96孔板（2×103个/细胞），按照“1.2.1”分组处理细胞，每孔加MTT 溶液20µL，培养4 h，弃上清，每孔别加入50 µL 二甲基亚砜（DMSO），用酶标仪检测490 nm处吸光度值（A值）。

利多卡因、miR-195过表达或抑制miR-195表达对顺铂敏感性检测：取0 mmol/L 组、2 mmol/L 组、4 mmol/L 组、NC 组、miR-con 组、miR-195 组、lidocaine +anti-miR-con 组、lidocaine +anti-miR-195 组对数生长期细胞，接种于96 孔板，加入不同浓度梯度顺铂（0.5、1、2、4、8、16 mg/L）的培养基处理24 h［8］，更换为MTT 与正常培养基的混合液（1∶9），避光孵育1 h，用酶标仪490 nm 检测吸光度值（A 值），计算半抑制浓度（IC50值）。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡取各组骨肉瘤MG63 细胞，加入500 µL 结合缓冲液，依次加5 µL Annexin V-FITC与5µL PI，避光孵育10 min，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.4 实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测细胞中miR-195、多药耐药相关蛋白1（MRP1）

mRNA 表达水平用Trizol 法提骨肉瘤MG63 细胞总RNA，反转录合成cDNA，以cDNA 为模板进行qRT-PCR 反应。miR-195 以U6 为内参，MRP1 以βactin 为内参，采用2-ΔΔCt法计算miR-195、MRP1 mRNA相对表达量。

1.2.5 蛋白质印迹法（Western blotting）检测cy clinD1、Cleaved-caspase-3 蛋白表达各组骨肉瘤MG63 细胞，室温条件下，800 r/min 转速离心5 min，弃上清液，加入蛋白裂解液提取细胞总蛋白，取适量蛋白上清液加入5×Buffer（4∶1），充分混匀，100 ℃煮沸10 min，采用12%凝胶100 V 恒压进行蛋白电泳实验，250 V 恒压转膜1 h，封闭1 h，加稀释为1∶1 000一抗，4 ℃孵育24 h，加稀释为1∶2 000二抗，室温孵育1 h 显影，应用ImageJ 软件分析各条带灰度值。

1.3 统计学方法用SPSS 21.0 统计学软件分析数据，计量资料以±s表示，每个实验重复3 次，多组间用单因素方差分析，组内两两比较用LSD 法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 利多卡因对骨肉瘤MG63 细胞的增殖的影响用不同浓度的利多卡因处理骨肉瘤MG63 细胞，MTT 法检测结果显示，与0 mmol/L 组相比，利多卡因2 mmol/L组、4 mmol/L组、8 mmol/L组、16 mmol/L 组细胞存活率显著降低（P＜0.05），呈时间-剂量依赖效应，见表1。

表1 不同浓度利多卡因对骨肉瘤MG63细胞不同处理时间存活率的影响/（%，±s）

表1 不同浓度利多卡因对骨肉瘤MG63细胞不同处理时间存活率的影响/（%，±s）

注：①与0 mmol/L组比较，P＜0.05。②与0 h比较，P＜0.05。

组别0 mmol/L 2 mmol/L 4 mmol/L 8 mmol/L 16 mmol/L F值P值重复次数3 3333 0 h 100.01±10.01 96.13±9.62①82.26±8.23①67.13±6.71①35.17±3.52①32.64＜0.001 24 h 100.00±10.12 90.46±9.05①70.05±7.01①②58.01±5.80①②24.09±2.41①②48.91＜0.001 48 h 101.27±10.13 82.16±8.22①②52.36±5.24①②38.11±3.81①②21.04±2.11①②73.48＜0.001 72 h 99.76±9.98 79.16±7.92①②55.28±5.53①②43.14±4.32①②23.75±2.38①②61.60＜0.001 F值0.04 7.10 39.63 57.49 49.76 P值0.989 0.001 0.000 0.000 0.000

2.2 利多卡因对骨肉瘤MG63 凋亡和化疗敏感性的影响与0 mmol/L 组相比，2 mmol/L 组、4 mmol/L组MRP1 mRNA表达水平、顺铂IC50值显著下降，凋亡率、Cleaved-caspase-3 蛋白表达水平增加（P＜0.05），见图1、表2。

图1 蛋白质印迹法（Western blotting）检测Cleave-caspase-3蛋白表达

表2 不同浓度利多卡因对骨肉瘤MG63细胞凋亡和化疗敏感性的影响/±s

表2 不同浓度利多卡因对骨肉瘤MG63细胞凋亡和化疗敏感性的影响/±s

注：Cleaved caspase-3为活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶。①与0 mmol/L组比较，P＜0.05。

组别0 mmol/L 2 mmol/L 4 mmol/L F值P值重复次数3 Cleave-caspase-3 0.15±0.02 117.32＜0.001细胞凋亡率/%8.22±0.82 82.43＜0.001 MRP1 mRNA 1.00±0.11±0.08①±0.05①36.06＜0.001对顺铂IC50/（mg/L）9.05±0.92 6.59±0.71①2.16±0.23①78.18＜0.001images/BZ_30_402_1858_918_1984.png

2.3 利多卡因对miR-195 表达的影响不同浓度的利多卡因处理后，2 mmol/L 组、4 mmol/L 组骨肉瘤细胞中miR-195 的表达水平显著高于0 mmol/L 组［（1.86±0.18）、（2.25±0.22）比（1.00±0.10），P＜0.05］。

2.4 上调miR-195 对骨肉瘤MG63 细胞增殖、凋亡和化疗敏感性的影响 miR-195 组miR-195 的表达水平、细胞凋亡率、Cleaved-caspase-3 蛋白表达水平明显高于miR-con 组（P＜0.05），cyclinD1 蛋白表达水平、MRP1 mRNA 表达水平、细胞存活率、顺铂IC50值明显低于miR-con组（P＜0.05），见图2、表3。

表3 miR-195过表达对骨肉瘤MG63细胞增殖、凋亡和化疗敏感性的影响/±s

表3 miR-195过表达对骨肉瘤MG63细胞增殖、凋亡和化疗敏感性的影响/±s

注：cyclin D1为细胞周期蛋白D1，Cleaved caspase-3为活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶。①与miR-con组比较，P＜0.05。

组别NC miR-con miR-195 F值P值重复次数333 miR-195 1.00±0.12 1.12±0.10 2.36±0.04①196.25＜0.001 cyclinD1 1.00±0.09 0.98±0.10 0.40±0.04①53.06＜0.001 Cleave-caspase-3 0.20±0.03 0.18±0.02 0.90±0.09①160.98＜0.001细胞存活率/%100.00±10.11 101.23±10.13 53.26±5.25①28.96＜0.001细胞凋亡率/%8.38±0.85 8.30±0.80 22.36±2.28①89.880＜0.001 MRP1 mRNA 1.00±0.11 0.68±0.07 0.40±0.04①43.61＜0.001对顺铂IC50/（mg/L）9.10±0.90 8.99±0.85 4.05±0.40①44.24＜0.001

图2 上调miR-195对骨肉瘤MG63细胞cyclinD1、Cleave-caspase-3蛋白表达的影响

2.5 低表达miR-195能够逆转利多卡因（4 mmol/L）对骨肉瘤MG63增殖、凋亡和化疗敏感性的影响 lidocaine+anti-miR-195 组cyclinD1 蛋白表达水平、细胞存活率、MRP1 mRNA 表达水平、顺铂IC50值明显高于lidocaine+anti-miR-con 组（P＜0.05），Cleavedcaspase-3 蛋白表达水平、细胞凋亡率显明显低于lidocaine+anti-miR-con组（P＜0.05），见图3、表4。

图3 蛋白质印迹法（Western blotting）检测cyclinD1、Cleave-caspase-3蛋白表达

表4 低表达miR-195能够逆转利多卡因对骨肉瘤MG63增殖、凋亡和化疗敏感性的影响/±s

表4 低表达miR-195能够逆转利多卡因对骨肉瘤MG63增殖、凋亡和化疗敏感性的影响/±s

注：cyclin D1为细胞周期蛋白D1，Cleaved caspase-3为活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶。①与NC组比较，P＜0.05。②与lidocaine+anti-miR-con组比较，P＜0.05。

组别NC lidocaine lidocaine+anti-miR-con lidocaine+anti-miR-195 F值P值重复次数3333 miR-195 1.00±0.09 2.20±0.22①2.25±0.25 1.35±0.13②34.29＜0.001 cyclinD1 1.00±0.11 0.40±0.04①0.42±0.05 0.88±0.09②47.46＜0.001 Cleave-caspase-3 0.25±0.02 0.98±0.10①1.00±0.11 0.40±0.04②75.30＜0.001细胞存活率/%100.00±10.18 53.68±5.28①50.88±5.11 92.46±9.25②32.30＜0.001细胞凋亡率/%8.54±0.85 29.88±3.00①30.86±3.09 15.49±1.55②66.73＜0.001 MRP1 mRNA 1.00±0.10 0.43±0.04①0.41±0.03 0.86±0.09②52.45＜0.001对顺铂IC50/（mg/L）9.15±0.95 2.20±0.25①2.12±0.22 8.14±0.81②101.99＜0.001

3 讨论

利多卡因可通过调节GOLT1A的表达而抑制肺癌细胞增殖［9］。利多卡因通过调节miR-539/EGFR分子轴抑制肺癌细胞发展［10］。利多卡因抑制胃癌细胞生长分化［11］。Bax 是Bcl-2 蛋白家族成员，可通过激活线粒体凋亡途径激活caspase 形成活化cas-pase，加快细胞发生凋亡［12］。本研究用利多卡因干预后，凋亡率、Cleaved-caspase-3 蛋白表达水平上调，细胞活性降低，说明利多卡因干预骨肉瘤细胞可抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，且呈剂量依赖效应。骨肉瘤的主要化疗用药是顺铂，其作用机制是促进细胞凋亡，而化疗耐药性是影响骨肉瘤化疗效果的重要原因［13］。研究报道指出七氟醚、异氟醚等可抑制骨肉瘤细胞增殖，还可影响细胞化疗敏感性［14］。因而积极探寻化疗增敏剂对提高骨肉瘤化疗效果具有重要意义。

MRP1 可通过将异型生物质运出细胞外而保护细胞，还可与抗肿瘤药物、铂类耐药等密切相关［15］。本研究结果显示利多卡因处理后骨肉瘤细胞中MRP1 表达水平显著降低，其对顺铂半抑制率浓度（IC50 值）显著下降，说明利多卡因可提高顺铂敏感性，提示利多卡因下调MRP1 表达从而提高细胞顺铂敏感性。

miR-195 可能通过抑制肝癌细胞增殖进而增加细胞对5-氟尿嘧啶药物敏感性［16］。研究表明miR-195 可能通过负向调控Raf-1 信号通路从而增加结肠癌细胞对奥沙利铂的敏感性［17］。miR-195 表达量降低与顺铂的化疗敏感性及胃癌患者预后不良密切相关［18］。本研究结果显示骨肉瘤细胞中上调miR-195 表达可抑制细胞增殖，细胞凋亡率显著增加，MRP1 mRNA 表达水平显著降低，IC50 值显著降低，说明上调miR-195 抑制骨肉瘤细胞增殖和诱导细胞凋亡，增加细胞化疗敏感性。cyclinD1 可促进肿瘤细胞增殖，还可通过与CDK4/CDK6结合从而促进细胞由G1 期转为S 期，促进细胞增殖［19］。本研究发现，上调miR-195 表达可降低cyclinD1 表达，提示上调miR-195 表达可能通过下调cyclinD1 而抑制骨肉瘤细胞增殖。本研究拟建立利多卡因与miR-195之间的作用关系，结果显示，利多卡因可增加miR-195的表达，抑制miR-195表达可逆转利多卡因对骨肉瘤细胞凋亡、增殖及化疗敏感性的作用。说明利多卡因可通过上调miR-195促进骨肉瘤细胞发展。

利多卡因可通过上调miR-195 的表达在骨肉瘤细胞顺铂抵抗形成过程中发挥重要抑制作用，利多卡因浓度为4 mmol/L 时作用效果较好，通过体外实验证实利多卡因可抑制骨肉瘤细胞增殖、促进细胞凋亡及增强顺铂化疗敏感性，可为临床合理应用利多卡因提供理论依据。