Slit分泌蛋白家族2/Slit分泌蛋白家族特异性受体1在骨髓增生异常综合征中的表达及意义

赵文凤，刘琼，李振宇，孙海英

骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome，MDS）是造血干细胞的克隆性骨髓增生性疾病，高风险向急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）转化［1］。研究表明，表观遗传学改变，尤其是DNA 甲基化的异常是导致MDS 疾病发生和发展的重要因素之一［2］。有研究提出，Robo 突变被定义为独立的预后因素，并且Robo1 改变作为MDS 进展的驱动因素［3］。Robo1-Robo4是跨膜受体家族，可作为神经系统的引导分子。Slit 家族是与这些受体结合的分泌糖蛋白［4］。Robo1 在正常骨髓造血细胞中高表达［5］，Slit2 在细胞质、细胞膜、细胞核中的表达依次升高［6］。Slit/Robo 信号通路最初在神经系统中被发现，其主要功能为介导中枢神经投射通路、轴突的导向及神经细胞的迁移。Slit2/Robo1信号传导途径通过影响肿瘤血管生成、肿瘤细胞的转移等多种途径，既可发挥促癌作用，又可发挥抑癌作用［3］。近年来，Slit2/Robo1 信号途径已被证实与实体癌的进展有关，但其在血液学恶性肿瘤中的作用仍不明确。本研究通过分析Slit2/Robo1 在MDS 病人中的表达，探究其在MDS 的发病机制及预后中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料以2017 年8 月至2019 年6 月就诊于徐州医科大学附属医院血液科的51 例初诊MDS病人为研究对象，收集入院时骨髓标本（其中再入院时为同一人的47 例），47 例中治疗有效29 例，治疗无效18 例。诊断、分期及疗效评价均符合文献［7］标准。初诊51例病人中男32例、女19例，中位年龄70（29～85）岁；根据WHO（2016）MDS 修订分型，MDS-SLD 9 例，MDS-MLD 10 例，MDS-RA 10 例，MDS-EB 14 例（EB-1 5 例，EB-2 9 例），MDS-U 8 例，对照组为10 例健康人。根据IPSS-R 评分，低危15例，中危9例，高危17例，极高危10例。病人对研究方案签署知情同意书。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 标本收集收集纳入研究对象及对照组入院首次髂后上棘骨髓8 mL，采用Ficoll 密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞（bone marrow mononuclear cells，BMMNC），-80 ℃冰箱冻存备用。

1.3 试剂与仪器 RIPA 裂解液（上海碧云天生物技术有限公司产品），SDS-PAGE 凝胶快速配胶试剂盒、BCA 蛋白测定试剂盒、ECL 试剂盒（上海碧云天

生物技术有限公司产品），β-action、抗Robo1 兔抗人单克隆抗体，抗Slit2 兔抗人单克隆抗体（美国proteintech 公司产品），TRIzol（美国ThermoFisher 公司产品），RT-PCR 试剂盒及SYBR Green qPCR 试剂盒（均为美国MCE 公司产品），qRT-PCR 仪为德国Roche 公司LightCycler480 型，NanoDrop-2000 仪（美国THermo公司产品）。

1.4 引物设计 Slit2、Robo1、β-action 引物由金唯智生物科技有限公司合成。Slit2 正向引物：5’-GGTGACGGATCCCATATCGCGGTAGAACTC-3’，反向引物：5’-GGACACCTCGAGCGTACAGCCGCACTTCAC-3’；Robo1 正向引物：5’-CCTACACAGATGATCTTCC-3’，反向引物：5’-CAGAGGAGCCTGCAGCTCAGCTTTCAGTTTCCTC-3’，β-action 正向引物：5’-CGTGGACATCCGCAAAGA-3’，反向引物：5’-GAAGGTGGACAGCGAGGC-3’。

1.5 实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应（qRTPCR）检测 Robo1/Slit2mRNA 在 MDS 病人BMMNC 中相对表达量采用TRIzol 试剂抽取总的RNA，NanoDrop-2000 仪测RNA 浓度。采用RTPCR 试剂盒逆转录合成cDNA。反应体系为20µL：cNDA 2 µL，Mix10 µL，引物0.8 µL，灭菌用水7.2µL。反应条件：95 ℃2 min 预变性，95 ℃10s、60 ℃20s、72 ℃20s，40 个循环。mRNA 相对表达量用2-ΔΔCt表示，以β肌动蛋白（β-actin）表达水平作为内部参照，分析各组Slit2、Robo1基因表达水平。

1.6 蛋白质印迹法（Western blotting）检测MDS病人BMMNC 中Slit2/Robo1 蛋白表达水平从

-80 ℃超低温冰箱里取出骨髓单个核细胞，在冰浴条件下裂解细胞、提取总蛋白。使用Nanodrop 2000c测定蛋白浓度，-20 ℃下保存。取等量蛋白加入等体积上样缓冲液，经SDS-PAGE 凝胶电泳后，用水浴式电转仪转至硝酸纤维素膜上。5%BSA 室温封闭2 h，加一抗稀释液（Slit2 为1∶1 000，Robo1 为1∶600）4 ℃孵育过夜。TBST 漂洗10 min×3 次，加入山羊抗兔HRP 标记二抗，室温反应1 h，TBST 漂洗10 min×3次，ECL显影剂显色，曝光显像。

1.7 疗效评定标准 MDS 的疗效标准参考2006 年IWG 修订分为完全缓解、部分缓解、骨髓完全缓解、疾病稳定、血液学改善、治疗失败、疾病进展。治疗失败、疾病进展纳入治疗无效组，其余纳入治疗有效组。

1.8 随访随访截止日期为2020 年12 月30 日，中位随访时间为18（7～40）个月，无失访病人。生存指标：总体生存（OS）时间为自确诊之日至死亡或末次随访时间。无进展生存（PFS）时间为自确诊之日至疾病发生进展或死亡的时间。

1.9 统计学方法采用SPSS 23.0 进行统计学分析。将Slit2、Robo1 基因mRNA 相对表达量乘以1 000 后取以10 为底的对数（lg），处理后的数据用±s表示。计量资料符合正态分布，治疗前正常与初治比较采用独立样本t检验，正常与不同IPSS-R 分组比较采用单因素方差分析，同一病人治疗前后采用配对样本t检验，多组之间均值比较采用单因素方差分析LSD 法，计数资料采用秩和检验，相关分析采用Pearson 相关检验或Spearman 相关性检验分析。Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，log-rank 检验用于估计单个危险因素的生存差异，预后多因素分析采用Cox回归分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MDS 病人BMMNC 中Slit2、Robo1 基因表达水平 qRT-PCR结果显示，Robo1mRNA在初诊病人高表达，Slit2mRNA 在初诊病人低表达，均与治疗疗效相关（P＜0.05）。初诊组Robo1mRNA 表达量明显高于正常对照组［（2.595±0.395）比（1.422±0.485）］，其中IPSS-R＞3 组Robo1mRNA 高于IPSS-R≤3 组［（2.744±0.284）比（2.271±0.370）］；Slit2mRNA 表达量低于正常对照组［（2.453±0.185）比（2.729±0.136）］，其中IPSS-R＞3 组Slit2mRNA 表达低于IPSS-R≤3 组［（1.409±0.343）比（2.406±0.187）］（P＜0.05）。治疗有效组中Robo1mRNA 表达量较治疗前明显下降［（0.911±0.153）比（2.828±0.243）］，Slit2mRNA 表达量较治疗前升高［（1.819±0.116）比（1.274±0.279）］（P＜0.05）。无效组Robo1mRNA 表达量明显高于治疗前［（3.553±0.395）比（2.116±0.137）］，Slit2mRNA 表达量明显低于治疗前［（1.429±0.390）比（2.453±0.185）］，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 MDS 病人BMMNC 中Slit2、Robo1 蛋白表达水平 Western blotting 结果显示，Robo1蛋白在初诊病人高表达，Slit2 蛋白在初诊病人低表达，均与治疗疗效相关（P＜0.05）。初诊组Robo1 蛋白表达量明显高于正常对照组［（2.595±0.395）比（1.422±0.485）］，其中，IPSS-R＞3 组Robo1 蛋白表达水平高于IPSS-R≤3 组［（1.563±0.113）比（1.002±0.056）］；Slit2 蛋白表达量低于正常对照组［（2.453±0.185）比（2.729±0.136）］（P＜0.05），其中，IPSS-R＞3组Slit2蛋白表达水平低于IPSS-R≤3 组［（1.593±0.339）比（1.921±0.558）］。治疗有效组中Robo1 蛋白表达量较治疗前明显下降［（0.911±0.153）比（2.828±0.243）］，Slit2 蛋白表达量较治疗前升高［（1.819±0.116）比（1.274±0.279）］（P＜0.05）。无效组Robo1蛋白表达量明显高于治疗前［（3.553±0.395）比（2.116±0.137）］，Slit2 蛋白表达量明显低于治疗前［（1.429±0.390）比（2.453±0.185）］，差异有统计学意义（P＜0.05），如图1，2。

图1 不同分组的MDS病人骨髓单个核细胞中Slit2蛋白表达量

图2 不同分组的MDS病人骨髓单个核细胞中Robo1蛋白表达量

2.3 MDS 病人Robo1、Slit2 基因mRNA 表达水平与临床特征的相关性分析经过检验发现，Robo1mRNA、Slit2mRNA、年龄、血红蛋白、平均红细胞体积、叶酸、血清白蛋白均为正态分布的数据，不同组间mRNA 表达量比较及相关性分析显示，Robo1 mRNA 表达水平与IPSS-R 分组、骨髓原始细胞数、年龄呈正相关，Slit2 mRNA 表达水平与IPSS-R 分组、骨髓原始细胞数、年龄呈负相关（表1，2）。

表1 不同临床特征组间mRNA相对表达量比较/±s

表1 不同临床特征组间mRNA相对表达量比较/±s

临床特征WHO分型SLD MLD RA EB U染色体核型简单复杂性别男女例数9 10 10 14 8 27 24 32 19 Robo1mRNA相对表达量2.51±0.43 2.52±0.49 2.17±0.00 2.71±0.32 2.47±0.51 2.55±0.44 2.64±0.35 2.57±0.43 2.64±0.35 t值0.829 0.625 0.498 P值0.519 0.537 0.622 Slit2mRNA相对表达量2.40±0.29 1.89±0.78 2.12±0.00 1.44±0.38 2.13±0.27 1.88±0.61 1.62±0.50 1.84±0.56 1.65±0.58 t值2.23 1.27 0.89 P值0.093 0.216 0.379

2.4 生存分析 51 例初诊MDS 病人的中位PFS 时间为10（95%CI：7～13）个月，中位OS 时间为18（95%CI：15～23）个月。以对照组Slit2、Robo1 mRNA表达水平为基线，分别将Slit2、Robo1 mRNA 的表达量分为高表达组和低表达组。Slit2 低表达组与高表达组的中位PFS时间分别为15（95%CI：5.4～24.5）和17（95%CI：4.7～7.7）个月（χ2=3.93，P=0.047），中位OS 时间分别为16（95%CI：10.2～21.7）和38（95%CI：26.5～49.4）个月（χ2=21.29，P＜0.001）。Robo1 低表达组与高表达组的中位PFS 时间分别为19（95%CI：11.5～21.4）和15（95%CI：6.5～23.4）个月（χ2=4.21，P=0.040），中位OS时间分别为34（95%CI：27.1～40.9）和16（95%CI：3.1～9.8）个月（χ2=10.76，P＜0.001）。Log-rank 检验结果显示，Robo1 高表达组（χ2=4.17，P=0.041）、Slit2 低表达（χ2=4.34，P=0.038）、IPSS-R 高危（χ2=4.48，P=0.034）、复杂染色体核型（χ2=8.62，P=0.003）与初诊MDS 病人预后不良显著相关。进一步将上述变量纳入Cox多因素回归分析发现，复杂染色体核型是独立于其他临床指标的预后危险因素（95%CI：0.050～0.751）（P=0.006）。

表2 MDS病人Robo1、Slit2基因mRNA表达水平与临床特征的相关性分析

3 讨论

多达30%的MDS 病人可发展为急性髓系白血病（AML），也是MDS 病人病死率高的原因［8］。表观遗传修饰在调节造血功能的自我更新和分化中起着关键作用，成为MDS 和AML 的主要致癌原因［9］。研究表明，DNA 甲基化在MDS 中起重要作用［10］。Robo1 受体结合Slit2 蛋白，并在轴突导向的发展中起关键作用，且Slit2/Robo1 信号的激活明显促进细胞凋亡和细胞G0、G1 期的周期阻滞，并抑制若干实体癌细胞的增殖和迁移，同时Slit2/Robo1 信号通路也可通过Robo4与未知配体的相互作用促进肿瘤血管生成［3］。Slit 是一组相对分子质量为170 000～190 000的细胞外分泌蛋白，其结构域组成包括N 端短的信号肽、4 个连续的富含亮氨酸的重复序列、9个表皮生长因子样功能区，1 个ALPS 区域和1 个C端富含半胱氨酸的区域［6］。其受体Robo 是一类保守的跨膜受体蛋白，包括5 个免疫球蛋白结构域，3个纤连蛋白结构域和1 个跨膜结构域［11］。Slit 的第二个LRR 结构域（D2）和Robo 的前两个N 末端Ig 结构域结合发挥作用，激活细胞内信号转导途径，以介导对细胞的生物学作用。钙黏蛋白（α-catenin）是介导细胞间相互作用的一种重要的细胞黏附分子，这些钙黏蛋白与适配器蛋白之间的干扰会降低细胞与细胞的黏附，故该蛋白的下调会导致肿瘤细胞转移。Slit2/Robo1 信号通路上调，通过泛素连接酶诱导蛋白酶体中钙黏蛋白复合物降解，从而影响MDS 肿瘤细胞迁移［4］。同时Slit2 与Robo1 异源二聚体的相互作用也增强了血管的完整性［12］。有研究证实在MDS 中，基因拷贝数（CN）丢失或LOH 突变或基因表达缺陷引起的蛋白质编码异常会导致Robo 功能受损。这种基因失活模式类似于“两次打击”理论，其中通过双等位基因突变（纯合子，约100%）使肿瘤抑制基因失活。但是，单等位基因突变（杂合子，约50%）在白血病或MDS中更为常见［3］。

Slit、Robo 基因突变导致Slit/Robo 信号通路受阻，通过调节肿瘤的血管生成、细胞侵袭、转移进而抑制或促进肿瘤发生［13］。研究发现，Robo1 在白血病细胞中普遍表达［14］，且Slit2 甲基化可发生在白血病细胞及套细胞淋巴瘤中［15］，但在MDS 中关于Robo1 的研究并不多见。本研究探讨了Robo1 及Slit2在MDS 病人骨髓单个核细胞中的表达情况，结果显示，与正常对照组病人相比，Robo1在MDS病人骨髓细胞中高表达量，Slit2在MDS病人骨髓细胞中低表达量。支持了既往文献报道的Robo1在白血病细胞中高表达，Slit2 低表达［14］。为了分析Slit2/Robo1 与MDS 病情进展关系，本研究分析了初诊MDS 不同IPSS-R 分组Slit2/Robo1 表达情况，随着病情进展，Robo1mRNA 的表达量越高（r=0.36），其中IPSS-R＞3病人Robo1 的表达量较正常对照组及IPSS-R≤3 组明显升高（P＜0.05）；而Slit2mRNA 的相对表达量有相反趋势，其中IPSS-R＞3 病人Slit2 的表达量低于IPSS-R≤3 组及正常对照组（P＜0.05）。文献报道，IPSS-R 评分标准对MDS 病人进行预后分组，得出各组危险度越高，染色体异常发生率越高，生存期越短，向白血病转化的风险越大［16］。本研究中Slit2/Robo1 表达水平与IRSS-R 评分相关，提示，Slit2/Robo1 对MDS 病人预后可能存在一定意义。 进一步分析Slit2/Robo1与疗效关系，结果显示，中高危病人治疗后，有效组Robo1 表达量降低，无效组升高，Slit2 表达量则相反，有效组较治疗前升高，无效组较治疗前降低（P＜0.05）。进一步行生存分析，根据对照组Robo1、Slit2 mRNA 的表达水平，将MDS病人的Robo1、Slit2 mRNA 表达情况分别分为高表达组和低表达组。利用Log-rank 检测，纳入常见预后指标及Robo1、Slit2 mRNA 表达分组。结果显示，Robo1 高表达、Slit2 低表达、IPSS-R 高危、复杂染色体核型与初诊MDS 病人预后不良显著相关。MDS 病人Robo1 高表达、Slit2 低表达是影响病人PFS 和OS的不良预后因素。由此推断，Slit2/Robo1 信号通路可能在MDS病人的发生、发展中发挥了重要作用。

在临床特征相关性分析中，Robo1 与Slit2 的表达分别与IPSS-R 分组、骨髓原始细胞数、年龄呈正相关及负相关。在其他Slit-Robo 表达与临床分期参数（例如WBC、血红蛋白水平、LDH 活性）之间均未发现相关性。目前，鲜有研究提到何种临床特征与Robo1、Slit2 表达相关，Gołos 等［14］研究结果显示，在＞60岁AML病人BMMNC中Robo1的表达更高，而在多数老年病人Slit2 表达较低，本研究与文献报道结果有大致相同趋势，未对年龄做进一步分组。因此，Slit2/Robo1 与临床特征相关性意义仍需大样本数据进一步研究。

综上所述，本研究结果显示，Slit2/Robo1 信号通路在骨髓增生异常综合征的发生发展中可能发挥重要作用。先前研究表明，Slit2/Robo1 信号传导可以使实体癌中的AKT/ GSK3/β-catenin 途径失活［17］。据报道，AKT/ GSK3 在MDS 特别是高级别MDS 中过度激活，并与细胞增殖和抗凋亡相关。Robo 突变导致Slit2/Robo1 信号通路失活，减轻了AKT/GSK3/β-catenin 通路的抑制作用，从而导致MDS 细胞增殖不受控制，进而导致疾病进展［18］。随着对表观遗传学的深入研究，人们发现DNA 过度甲基化与MDS 和AML 的发生、进展密切相关，提示抑制DNA 甲基化可成为治疗的一个新靶点［16］。临床上常使用DMNT 抑制剂，如地西他滨、阿扎胞苷，可以有效延长MDS 病人的生存期［19］。关于Slit2/Robo1信号通路的研究为治疗MDS提供了一个潜在靶点，其信号通路激活剂有可能成为治疗MDS 的新型靶向药物。本研究畅想Slit2/Robo1通路激活剂联合DMNT 抑制剂或普通化疗或许可以克服改善疗效、降低AML转化率，此方向仍需我们进一步研究。