泛素特异性肽酶22、滋养层细胞表面抗原-2表达与鼻咽癌临床病理特征的关系及对预后的影响

王在凡，王蕊，李海涛

调查显示，鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）患病率居耳鼻喉头颈部恶性肿瘤第1 位，具有易浸润性、高转移性、易复发等多种特点［1-2］，但目前临床尚未完全明确NPC 的病因及发生机制。相关研究指出，Trop2 在人体正常细胞中呈相对低表达状态，但在结肠癌、肺鳞癌等多种肿瘤组织中呈异常高表达［3］。USP22 作为肿瘤干细胞标志家族中重要成员，具有去泛素化作用，可利用底物靶分子的去泛素化修饰作用，达到调节细胞多种基因转录的目的［4］。目前临床实践已发现USP22、Trop2 在肺癌、肠癌、胃癌等多种肿瘤中呈高表达状态［5］。但二者在NPC 中相关研究鲜有报道。鉴于此，本研究以USP22、Trop2 蛋白表达为观察指标，旨在探讨其与NPC 病人临床病理特征的关系及对预后的影响。具体分析如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料从2014 年1 月至2016 年6 月于安阳市眼科医院就诊的鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）病人中选取符合后述入排标准的病人92 例及对应的组织标本作为观察组，其中男70 例，女22 例，年龄（50.95±5.21）岁，范围为40～68 岁；体质量指数（BMI）（22.84±2.03）kg/m2，范围为18.5～27.6 kg/m2；其中76 例鳞状细胞癌，1 例黏液表皮样癌，7例淋巴上皮瘤样癌，4例腺癌，2例柱状细胞癌，2 例腺样囊性癌；另选取同期通过病理检验排除鼻咽癌而被确诊为慢性鼻咽炎病人及其组织标本95例作为对照组，其中男72 例，女23 例，年龄（51.27±4.98）岁，范围为41～69 岁；BMI（23.15±2.14）kg/m2，范围为18.3～27.8 kg/m2。两组基本资料（年龄、性别、BMI）均衡可比（t=0.43，P=0.668；χ2=0.00，P=0.962；t=1.02，P=0.311）。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 选取标准

1.2.1 纳入标准 （1）观察组均符合以下标准：参照《2016 英国国家多学科指南：鼻咽癌》［6］中NPC 诊断标准，TNM 分期为Ⅰ～Ⅳ期；均经鼻咽活检病理检查、颅神经检查、全细胞计数等证实为NPC；Karnofsky（KPS）评分≥70 分；术前无放化疗；（2）对照组均伴有鼻咽干燥不适、黏稠样分泌物不易咳出等临床表现，同时经纤维鼻咽镜、血常规等检查确诊；（3）两组临床资料完整，且病人及近亲属知情并签署承诺书。

1.2.2 排除标准 （1）肝肾等重要脏器器质性病变者；（2）入院前接受放疗、化疗或其他抗肿瘤治疗者；（3）凝血机制紊乱或活动性内出血者；（4）合并其他部位恶性肿瘤者；（5）继发性或原发性认知功能障碍或精神行为异常者。

1.3 方法

1.3.1 试剂兔抗人USP22 多克隆抗体、兔抗人Trop2 多克隆抗体均购自英国Abcam 公司、即用型快捷免疫组化MaxVision 试剂盒、DAB 显色试剂盒、抗原修复液等试剂购自深圳欣海凌生物科技有限公司。

1.3.2 免疫组织化学染色收集观察组的NPC 组织及对照组的鼻咽黏膜组织，用4%的中性甲醛溶液固定，石蜡包埋。应用免疫组织化学MaxVision法进行染色，操作严格按照说明书执行。具体步骤：常规石蜡切片、二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水，枸

橼酸盐修复液高压修复3 min，免疫组化笔在检测组织外围（约1～2 mm）处划圈，3%过氧化氢孵育20 min，封闭内源性过氧化物酶，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗3 次，加入适量正常羊血清（10%），室温条件下封闭15 min，弃血清，滴加兔抗人Trop2 多克隆抗体（1∶500 稀释）或兔抗人USP22 多克隆抗体（1∶200 稀释）一抗，4 ℃下孵育1 h，PBS 洗涤3 次后加入二抗，室温孵育15 min。PBS 洗涤3 次，DAB 显色、苏木素复染、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。同时以自身对照作为阳性对照，以PBS 代替一抗作阴性对照。

1.3.3 免疫组化结果判定［7］由2 位病理科医师双盲条件下使用高倍显微镜观察切片，结果不一致时协商统一判定结果。USP22蛋白着色主要定位于细胞质，Trop2 蛋白着色主要定位于细胞膜和细胞质，根据染色阳性细胞所占同类细胞总数百分比分为四级：0 分为＜1%，1 分为1%～10%；2 分为11%～50%；3 分为＞50%。染色强度根据肿瘤细胞着色深浅计分：0 分为无着色；1 分为黄色为弱阳性；2 分为浅棕色为中等阳性；3 分为棕褐色为强阳性。根据切片中阳性细胞数比例、细胞着色强度评分的乘积进行判定：0 分为阴性，1～2 分为弱阳性，3～4 分为阳性，＞4 分为强阳性，统计学处理时将分级≥1 分归为阳性。

1.4 观察指标 （1）对比两组USP22、Trop2 蛋白表达水平。（2）采用受试者工作特征曲线（ROC）分析USP22、Trop2 诊断价值。（3）对比不同临床病理特征病人USP22、Trop2 表达阳性率。（4）采用Pearson 线性相关性分析USP22、Trop2蛋白阳性率NPC临床病理特征关联性。（5）对比不同USP22、Trop2蛋白表达水平病人3 年生存率。（6）采用Kaplan-Meier（KM）曲线分析生存价值。

1.5 统计学方法采用SPSS 22.0 软件分析处理数据。计数资料用例（%）表示，组间比较采用χ2检验。此外，采用Logistic回归进行影响因素分析。采用Pearson 进行线性相关性分析。采用ROC 曲线评估诊断价值。采用KM 曲线进行生存曲线分析，采用Log-Rank 检验比较两组生存率。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组USP22、Trop2 蛋白表达水平观察组USP22、Trop2 蛋白阳性表达率高于对照组（P＜0.05），见表1。

表1 两组USP22、Trop2蛋白表达水平比较/例（%）

2.2 USP22、Trop2 诊断价值 USP22、Trop2 联合诊断的准确性、敏感性均高于二者单一诊断；两者联合诊断特异性与单一诊断无明显差别，见表2。

表2 USP22、Trop2蛋白对NPC诊断价值/%

2.3 不同临床病理特征病人USP22、Trop2 蛋白阳性表达率不同病理分型、年龄、性别病人USP22、Trop2蛋白阳性表达率差异无统计学意义（P＞0.05）；TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化、淋巴结转移的NPC 病人组织标本中USP22、Trop2 蛋白阳性表达率高于TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期、中高分化、无淋巴结转移者（P＜0.05），见表3。

2.4 USP22、Trop2蛋白表达的影响因素分析（多因素综合分析） 建立非条件logistic 回归模型，以本研究资料为样本，再分别以USP22、Trop2 蛋白表达情况为应变量，赋值1=阳性表达，0=阴性表达。以上述单因素分析（表3）中P＜0.10 的指标/因素为自变量。各变量赋值见表4。回归过程采用逐步后退法，以进行自变量的选择和剔除，设定α剔除=0.10，α入选=0.05。回归结果显示：TNM分期、淋巴结转移、分化程度等3 个因素均为USP22、Trop2 蛋白表达的影响因素或关联因素（P＜0.05）。

表3 不同临床病理特征病人USP22、Trop2蛋白阳性表达率比较/例（%）

表4 Logistic回归结果

2.5 USP22、Trop2 蛋白水平与NPC 临床病理特征关联性 Pearson 线性相关性分析，USP22、Trop2 蛋白水平与TNM 分期、淋巴结转移呈正相关，与分化程度呈负相关（P＜0.05），见表5。

表5 USP22、Trop2蛋白水平与NPC临床病理特征关联性

2.6 不同USP22、Trop2 蛋白表达水平病人3 年生存率 USP22、Trop2 蛋白阳性表达病人3 年总生存率、无进展生存率低于阴性表达病人，均差异有统计学意义（P＜0.05）。见表6。

表6 不同USP22、Trop2蛋白表达水平病人3年生存比较/例（%）

2.7 生存分析随访3 年，以ROC 曲线最佳截断值分为低危组、高危组，KM 曲线分析显示USP22 蛋白、Trop2 蛋白高危组、低危组生存曲线有较明显的差别。经Logrank 检验，两组生存率差异有统计学意义（χ21=8.95，P1=0.003；χ22=20.57，P2＜0.001）。

3 讨论

研究发现，由于NPC 发病部位多位于鼻咽部较深位置，确诊时已有60%～70%病人出现局部进展［8］，严重降低NPC 病人生存率。现阶段临床尚未完全明确NPC 致病及其进展的分子机制，临床实践表明，NPC 分子致病机制多认为与主要原癌基因、抑癌基因的异常表达与改变及Akt 信号通路、丝裂原蛋白激酶通路、Wnt 信号通路的改变等有关［9］。因此，深入研究NPC 分子机制，对提高NPC 病人生存率具有积极作用。

USP22 是细胞信号网络中的枢纽分子，可通过去除泛素连接蛋白底物上的泛素，控制泛素化过程，降解细胞内多种蛋白，调节抗原呈递、肿瘤形成、信号转导、转录调控等一系列细胞内活动［10］。莫文法等［11］采用免疫组化法检测60例NPC组织、20例鼻咽黏膜慢性炎组织发现，USP22 蛋白阳性表达率在NPC 病人中呈高表达状态，支持本研究观点。充分表明USP22 蛋白在NPC 肿瘤细胞的生长过程中发挥致癌因子作用，USP22 蛋白阳性表达率升高可激活c-Myc 转录，下调AKT/GSK-3/Cyclin 通路中的p-AKT、p-GSK-3β、cy-clinD1 表达，影响细胞增殖周期，同时通过去泛素化端粒重复序列连接因子1（TRF1），一定程度可干扰TRF1稳定性，参与端粒维持，从而促进肿瘤细胞增殖、生长、侵袭［12］，另外通过刺激局部黏着斑酶信号通路、去泛素化上皮间质转化因子通路，能加快上皮间质转化进程，导致恶性肿瘤侵袭、癌细胞转移。此外，经logistic 回归及Pearson 线性相关性分析可知，USP22 蛋白水平与TNM 分期、淋巴结转移、分化程度存在有密切关联，与罗铮铮［13］研究一致，说明USP22 具有促进NPC 细胞增殖、提高局部浸润扩散能力的作用，有望成为评估NPC恶性程度、浸润侵袭的重要指标。

最后，对比不同USP22 蛋白表达水平病人3 年生存率可知，USP22 蛋白阳性表达病人3 年总生存率、无进展生存率明显低于阴性表达病人，进一步证实USP22 蛋白有望成为预测NPC 预后的肿瘤标志物及生物治疗靶点。

Trop2 可通过激活MAPK/ERK 激酶通路，诱导细胞增殖、迁移、分化及凋亡，参与肿瘤的发生、发展［14-15］。本研究对比两组Trop2蛋白表达水平发现，NPC 组织标本中Trop2 蛋白阳性表达率明显高于慢性鼻咽炎组织标本，与李赞华［16］观点相似，说明Trop2 蛋白具有致癌功能。袁广全［17］研究也证实，Trop2 能激活ERK/MAPK 信号通路，提高细胞周期蛋白D1、cyclinE的表达，调节细胞周期进程，同时随NPC 发生发展，Trop2 蛋白表达增强，可降低细胞黏附能力，引发细胞连接紊乱，导致癌细胞从原发灶脱落，从而促进细胞致癌性转化，加快肿瘤血管形成，增强鼻咽癌侵袭、转移行为，抑制NPC 细胞凋亡。另外，本研究应用ROC 曲线对Trop2 蛋白诊断NPC 价值进行评估，结果发现，Trop2 蛋白诊断NPC准确性（75.40%）＞USP22 蛋白（73.80%），但二者诊断敏感性均＜67.00%，故建议临床加强Trop2、USP22蛋白表达水平联合检测，以便及早检出NPC 高危人群，抑制病情进展。此外，分析Trop2 蛋白表达与NPC临床病理特征关系得出，Trop2蛋白表达水平在TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化、淋巴结转移的NPC 组织中呈异常高表达状况，与陈顺金等［18］研究相符，提示Trop2 蛋白可能与NPC 病人预后存在密切联系。进一步经Log-Rank 检验得知，Trop2 蛋白阳性高表达水平会增加NPC 病人死亡风险，充分说明Trop2 蛋白可作为预测NPC 病人预后的潜在有效指标。

综上可知，Trop2、USP22 蛋白表达水平在NPC病人中呈异常高表达状态，与TNM 分期、分化程度、淋巴结转移存在一定关联性，加强Trop2、USP22 蛋白表达水平联合检测，对早期识别NPC、评估预后具有重要指导意义。