磷酸化的MAPK作用激酶1表达与鼻咽癌发生发展及预后的关系

张贵，尚蕾，李晓玲，代文意，李颖

鼻咽癌（NPC）是东南亚及我国南部发病率较高的头颈部恶性肿瘤疾病［1］。鼻咽部结构隐匿，发病一般源于鼻咽部的咽隐窝和顶后壁，早期临床症状不明显，一旦确诊大多数发展为中晚期，临床症状复杂多样［2］。颈部淋巴结转移是较常见，放化疗是鼻咽癌治疗的首选方案，但局部复发和远处转移率仍较高，是影响预后的主要因素［3-4］。NPC 发病机制目前尚未明确，研究信号转导分子在鼻咽癌发生发展机制中的作用，寻找能准确反应鼻咽癌诊断、病情发展程度、淋巴结转移、TNM 分期等分析诊断标志物是临床热点。有研究报道［5-6］MAPK/MnK 信号转导通路与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关，而MnK1 激酶磷酸化是该信号转导途径激活的关键。为进一步确定MAPK/MnK 信号转导通路在鼻咽癌发病机制中的作用，本研究对比分析鼻咽癌病人与对照组血清pMnK1蛋白阳性率差异及与TNM分期、淋巴转移的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2015 年1 月至2017 年7 月南阳市中心医院收集的90 例鼻咽癌病理学标本为鼻咽癌组、90 例经病理学检查证实鼻部慢性炎症的鼻黏膜组织为对照组。鼻咽癌组，年龄（58.2±9.1）岁，范围为44～75岁，男74例、女16例；TNMⅠ期20例、Ⅱ期35例、Ⅲ期28例、Ⅳ期7例；分化型非角化型癌18 例、未分化癌72 例；淋巴结转移阳性44 例、阴性46 例。对照组年龄（59.0±12.0）岁，范围为42～75岁；男70 例、女20 例。两组年龄、性别比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 入选标准 （1）鼻咽癌的诊断标准参考2015年NCCN 临床实践指南中鼻咽癌的诊断标准；（2）纳入对象的年龄≤75 岁；（3）病人经鼻咽喉镜取鼻咽部组织进行病理学活检证实；（4）病人或其近亲属知情同意；（5）本研究符合《赫尔透辛基宣言》相关伦理及保密原则。

1.3 排除标准 （1）转移性、复发性鼻咽癌病人；（2）在获取标本前具有放化疗史、免疫学治疗病史；（3）伴有其他系统的重大疾病；（4）免疫疾病或长期使用糖皮质激素治疗的病人。

1.4 免疫组化染色方法及评价标准 （1）用二甲苯将石蜡切片透明5 min，并泡2 次；依次用100%，95%，75%，50%乙醇梯度复水，每次浸泡2 min，最后用自来水冲洗。（2）柠檬酸高压1.5 min 以修复组织。（3）PBS冲洗3次，每次3～5 min。除去PBS液，向每张切片中加50µL 3%过氧化氢以阻断内源性过氧化物，并在室温条件下孵育10 min，PBS冲洗3次，每次3 min，除去PBS 液。（4）50µL 非免疫山羊血清分别滴加至每张切片，室温下孵育10 min，直接甩去血清。（5）均向每张切片中加入50 µL 的第一抗体pMnK1 抗体（美国Abcam 公司，1∶100稀释），置于室温条件下孵育60 min。PBS冲洗3次，每次3～5 min。除去PBS 液，再加入50 µL 即用型MaxVision 试剂，室温下孵育15 min。（6）PBS 冲洗3 次，每次3 min。（7）除去PBS液，加100µL DAB显色液（新配制），作用5 min，显微镜下观察。（8）自来水冲洗，并用苏木素复染，自来水冲洗后返蓝，浓度梯度乙醇以脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。（9）镜下阅片、摄像。

免疫组化结果判定：pMnK1 蛋白阳性着色表达于细胞核、细胞质，呈黄色、棕黄色、褐色表达，（1）根据着色强度：0 分为无色、1 分为淡黄色、2 分为棕黄色、3 分为褐色、黑色；（2）根据阳性细胞比例：阳性细胞数目所占比例≤10%为1分、阳性细胞所占比例11%～50%为2 分、阳性细胞数51%～75%为3分、阳性细胞数所占比例＞75%为4 分，两种积分相乘总分＜3分为阴性、≥3分为阳性。

1.5 统计学方法采用SPSS 21.0 版本对本研究的数据进行统计学处理，采用±s表示符合正态分布的计量资料，两组间分析采用t检验；计数资料组间分析采用χ2检验；生存分析采用Kaplan-Meier法，生存时间比较采用Log-rank 法；P＜0.05 说明差异有统计学意义。

2 结果

2.1 鼻咽癌组织与对照组的pMnK1蛋白阳性率比较鼻咽癌组的pMnK1 蛋白阳性率74.44%高于对照组的26.67%，差异有统计学意义（χ2=41.10，P＜0.05）。见表1。

表1 鼻咽癌组织与对照组的pMnK1蛋白阳性率比较/例（%）

2.2 鼻咽癌组织pMnK1蛋白阳性率表达与病理学特征的关系不同TNM 分期、淋巴结转移的鼻咽癌组的pMnK1蛋白阳性率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；在不同年龄、性别、不同组织学类型的鼻咽癌组的pMnK1 蛋白阳性率差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 鼻咽癌组织pMnK1蛋白阳性率表达与病理学特征的关系

2.3 预后情况分析经2 年随访，pMnK1 蛋白阳性的鼻咽癌病人失访4 例、阴性病人失访1 例，pMnK1蛋白阳性的鼻咽癌病人2 年生存率61.90%与阴性病人的77.27% 差异无统计学意义（χ2=1.71，P=0.191）。见表3。pMnK1 蛋白阳性的鼻咽癌病人的生存时间20.0 个月短于阴性组23.0 个月，差异有统计学意义［Log-rank（Mantel-Cox）=3.285，P＜0.05］。见图1。

表3 鼻咽癌组织pMnK1蛋白表达与2年生存率的关系/例（%）

图1 pMnK1蛋白不同表达程度病人的生存函数图

3 讨论

鼻咽癌是源于鼻黏膜上皮的恶性肿瘤，其发病率呈逐年上升趋势。影响鼻咽癌发病的因素复杂，包括：环境、饮食习惯、生活方式等，鼻咽癌发病率与地区有关，一般好发于东南亚和中国南部，男性发病率约为女性的2 倍，集中于40～50 岁［7-8］。由于鼻咽部结构隐匿，故早起临床症状不明显，部分病人早期偶有涕中带血，时有时无，瘤体增大可阻塞鼻孔后出现单侧性鼻塞，继而表现为双侧。若鼻咽癌起源于咽隐窝，随着瘤体增大可阻塞压迫咽鼓管咽口，表现为耳鸣、声音嘶哑、耳闷、听力下降。瘤体通过咽隐窝处的破裂口可转移至颅内，首先侵袭第Ⅴ、Ⅵ脑神经，接着侵袭第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ脑神经，表现为面部麻木、眼球活动受限、上睑下垂等一系列神经累及症状。瘤体进一步侵犯、转移，可侵袭第Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ脑神经，临床表现为软腭瘫痪、呛咳、伸舌偏斜等症状［9-10］。临床诊断一般以临床症状为基础结合可全面、精确显示瘤体大小、范围、部位的CT等影像学检查、病理学检查结果确诊，且正确率较高。寻找新的灵敏度高、特异性好的血清学诊断指标辅助诊断鼻咽癌，对提高鼻咽癌诊断正确率，降低诊断阴性率、误诊率、漏诊率等具有重要意义。

鼻咽癌的发生发展是由多基因多步骤进行的动态过程，其发病机制复杂，目前尚未完全阐明。真核细胞翻译起始因子-4E（eIF4E）是AKT/mTOR 信号通道、MAPK/MnK 信号通路的中心集结点，AKT/mTOR信号通路激活可诱导eIF4E活性异常表达，进一步激活肿瘤相关蛋白（VEGF、MMP-9、bcl-2 等）的表达，促进恶性肿瘤的发生发展［11］。有研究报道［12］eIF4E 的异常表达与多种人类恶性肿瘤如肺癌、乳腺癌、结直肠癌、鼻咽癌等。MAPK作用激酶1（pMnK1）是催化eIF4E 磷酸化的主要激酶。pMnK1通过促进与eIF4E 相互结合，形成pMnK1-eIF4E 复合物，促进eIF4E Ser-209 磷酸化，增强与mRNA 帽型结构的亲和力，提高mRNA 帽性依赖蛋白的翻译效率，最终促进肿瘤相关蛋白合成，是肿瘤生长增殖的关键过程。有研究报道［13］eIF4E 磷酸化活性异常高表达可促进细胞因子、炎症因子的表达，是多种恶性肿瘤预后差的标志。有研究通过给予MnK1抑制剂发现恶性肿瘤的生长速度减慢，肿瘤转移得到控制。说明MnK1抑制剂可通过MnK1失活，特异性靶向抑制eIF4E 磷酸化，进而抑制细胞增殖促进细胞凋亡，抑制肠癌移植瘤的生长和黑色素瘤的肺转移。本研究结果发现，鼻咽癌病人较对照组病人相比，pMnK1蛋白阳性率显著上升，且与TNM 分期、淋巴结转移有关。与既往研究报道一致［14-15］。说明MnK1 磷酸化水平与鼻咽癌细胞增殖、转移、生存期密切相关。提示，临床可针对抑制MnK1 磷酸化活性药物靶向抑制恶性肿瘤细胞增殖分化，诱导肿瘤细胞凋亡，从而特异性抗癌，提高治疗效果的同时，降低不良反应的发生。本研究结果还发现，pMnK1蛋白表达阳性的鼻咽癌病人其生存时间显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），说明抑制MnK1 磷酸化是治疗鼻咽癌延长病人生存期的重要治疗思路。

综上所述，鼻咽癌组织中pMnK1 蛋白呈高表达，并且与肿瘤的发生发展及不良预后关系密切。本研究创新处，不仅从分子机制确定pMnK1 蛋白水平在鼻咽癌诊断和病情评估中的临床价值，且为鼻咽癌的靶向治疗提供新的思路，具有重要的临床指导意义。