芥蓝BoaBKI1基因的克隆及表达分析

梁 莎，黄文莉，李香香，王依霖，张晨璐，张 芬，孙 勃

（四川农业大学园艺学院，成都 611130）

芥蓝（Brassica oleracea var.alboglabra）是十字花科芸薹属一、二年生草本植物[1]，原产于中国南部[2]，是我国的特色蔬菜之一，以花薹和嫩叶供食用，兼备营养价值和药用价值。芥蓝富含维生素C、类胡萝卜素、多酚和芥子油苷等多种生物活性物质，在抗氧化及抗癌等方面作用显著[3-4]。

油菜素甾醇（brassinosteroids，BRs）是一类植物激素，存在于植物大部分器官中。它们在植物的生长发育和环境适应性过程中占据着重要地位[5-6]，包括促进细胞的伸长、分裂和衰老、促进维管束的分化、调节雄性育性和抗逆性以及影响光形态的建成等[7-9]。1979年，人们首次在油菜的花粉中得到纯化的油菜素甾醇，迄今为止分离出的BR类化合物已经超过70种[10]。

从发现BR开始，科研人员一直在鉴定其各种组分，并不断探索它的合成途径，在1997年成功克隆了第一个BR不敏感突变体，意味着BR信号转导通路的研究进入了新阶段[11]。此后，人们通过遗传学和生物化学等方法，探索出BR信号转导途径的一部分，并初步研究了BR对植物生长发育的调控机制。BR在细胞膜上首先被富含亮氨酸的受体激酶BRI1（brassinosteroid-insensitive 1）所感知，随后BRI1和BAK1（BRI1-associated receptor kinase 1）受体复合物被激活并启动多重激酶和磷酸酶的级联反应，导致 BES1（BRI1-EMS-suppressor 1）和 BZR1（brassinazole resistant 1）等相关转录因子的去磷酸化和活化，实现信号向下游的传递，调控目标基因表达[12]。在整个信号传导过程中，BRI1及其他多个组分的突变均会使BR信号减弱，从而导致植物生长异常，例如植株矮小、延迟开花以及雄性不育等，而增强BR信号可以促进植物生长和纤维素的生物合成[13]。

BKI1（BRI1 kinase inhibitor 1）是BR信号通路中的一种重要调节因子。在拟南芥的研究中发现，BKI1是一种受体激酶抑制剂，是缺少BR时使BRI1处于基础水平所必需的。它通过阻断BRI1与BAK1结合，阻止活性受体复合物的产生来负调节质膜上的BRI1[14]。当用BR处理后，磷酸化的BKI1能够与14-3-3蛋白作用，竞争性抑制后者与BES1的结合，促进BES1的去磷酸化，行使对BR信号转导的正调控功能。因此，BKI1在BR信号通路中起到正负调控的双重作用[5]，但具体作用机制还不清楚。

蔬菜作物的生长发育和抗逆与BR途径密切相关。一直以来，关于BR的信号传导途径的研究大多是围绕于拟南芥和烟草等模式植物[15]，而在芥蓝等芸薹属蔬菜中的研究还鲜有报道。本试验克隆芥蓝BoaBKI1基因的全长，并对其进行序列分析和时空表达分析，以期丰富对芥蓝油菜素甾醇研究的认知，为进一步研究芥蓝中油菜素甾醇的信号传导机制奠定一定分子基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验以白花芥蓝品种‘四季粗条’为材料。芥蓝种子浸湿于25℃培养箱放置2 d，取萌动种子材料，其余种子继续培养成植株至成熟结荚。在生长过程中，分别对其不同时期（子叶期、真叶期和成熟叶期）、成熟期不同器官（幼果、果荚、叶片、叶柄、花序、根系和花薹）、花蕾期花器官（花瓣、花萼、雄蕊、雌蕊）和盛开期花器官（花瓣、花萼、雄蕊和雌蕊）进行取样[16]，每个样品取3个重复，每个重复各2 g，经液氮速冻后置于-80℃冰箱保存，用于后续试验。

1.2 试验试剂

反转录试剂盒、载体T-vector pMD19购于大连宝生物公司，Taq酶购于北京全式金生物技术股份有限公司，DNA胶回收试剂盒购于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 DNA提取

以芥蓝叶片为材料，采用CTAB法进行DNA的提取，将产物置于-20℃保存备用。

1.4 总RNA提取及cDNA合成

以芥蓝分别以芥蓝不同时期叶片、成熟期不同器官以及花蕾期和盛开期的花器官为材料，使用改良CTAB法提取对应的总RNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测其质量。取用质量合格的总RNA参照反转录试剂盒说明书进行cDNA的合成，将产物置于-20℃保存备用。

1.5 BoaBKI1基因克隆

根据NCBI网站已公开的近源物种甘蓝、白菜等BKI1基因的序列设计引物（表1），并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以DNA和cDNA分别为模板，使用全式金TranStart FastPfu Fly DNA PolymeraseTaq酶进行扩增，PCR扩增反应体系为：模板2 μL，上下游引物10 μmol/L各2 μL，10×PCR Buffer 10 μL，2.5 mmol/LdNTP 4 μL，Taq酶 1 μL，DEPC处理水29 μL。PCR反应条件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s，57 ℃ 20 s，72 ℃ 15 s，循环数40；最后72℃延伸10 min。将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测后，用DNA胶回收试剂盒纯化回收目的基因BoaBKI1条带。

表1 芥蓝BoaBKI1克隆和表达所用引物Table 1 Primer sequences for cloning and expression of BoaBKI1 genes in Chinese kale

连接目的基因片段至T-vector pMD19，16℃下过夜。将连接产物加入大肠杆菌感受态中，涂布于含Amp的LB固体培养基上，于37℃培养过夜。挑取培养基的单克隆菌落，于LB液体培养基扩大培养，菌液PCR后筛选阳性克隆，送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，对测序结果进行比对分析。

1.6 生物信息学分析

利用NCBI-ORF、ProtParam、DNAStar、SignaIP、softberry-ProtComp、TMHMM、NCBI-CDD、DNA-man和MEGA 6.0等软件，对得到的BoaBKI1基因核苷酸序列进行开放阅读框寻找[17]、计算分子量、等电点和不稳定系数，蛋白质二级结构预测，信号肽预测、亚细胞定位预测、跨膜区预测和保守结构域分析，氨基酸多重序列比对及系统进化树的构建[18]。

1.7 基因表达半定量分析

根据已克隆得出的芥蓝BoaBKI1基因序列，设计半定量引物BKI1semiRT，内参基因β-actin参考引用Yi D.X.等的引物（表1）[19]。以芥蓝不同时期、不同组织器官的cDNA为模板，进行半定量PCR分析。使用2×Easy TaqPCR SuperMix for PAGE进行扩增，扩增体系为：cDNA模板1 μL，上下游引物10 μmol/L各 1 μL，2×Easy TaqPCR SuperMix 10 μL，DEPC 处理水 7 μL。扩增条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，BoaBKI157 ℃ 30 s，β-actin55℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；最后72℃延伸10 min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，采用Gel-Pro软件对电泳结果进行光密度定量分析，基因表达水平用相对于β-actin基因表达量的百分数值表示，3次重复，所得数据用Microsoft Excel 2013和SPSS 18.0软件进行整理和统计分析。

2 结果与分析

2.1 芥蓝BoaBKI1基因克隆

分别以芥蓝DNA和cDNA为模板进行PCR扩增，电泳检测发现条带均约1 000 bp，与预测片段的大小相符（图1），然后分别进行PCR产物的回收、连接至载体、转化，挑取阳性克隆进行测序，两者的测序结果完全一致，测序所得序列为1 026 bp，将该基因命名为BoaBKI1，其在GenBank中的登录号为：KX426041。

图1 BoaBKI1基因PCR扩增产物Figure 1 PCR amplification product of BoaBKI1

2.2 序列分析

利用NCBI、DNA-man软件对芥蓝BoaBKI1基因进行基因结构分析，发现该基因只有一个外显子，并无内含子。进一步通过NCBI-ORF、ExPASy软件对芥蓝BoaBKI1基因所编码的氨基酸进行理化分析，结果表明BoaBKI1由20种氨基酸共341个氨基酸残基组成，其理论分子量为37.30 kD，等电点为9.67，分子式为C1603H2586N476O534S7，不稳定指数为54.20，是不稳定蛋白。

利用DNAstar软件对芥蓝BoaBKI1蛋白二级结构进行预测分析（图2），依据Chou-Fasman法，发现BoaBKI1蛋白的α螺旋结构有8个，β折叠结构有7个，β-转角结构有31个；KarplusSchultz法预测BoaBKI1柔性结构区段有12个；KyteDoolittle法预测BoaBKI1蛋白大多数氨基酸为亲水性氨基酸。

图2 BoaBKI1蛋白二级结构预测Figure 2 Secondary structure prediction of BoaBKI1 protein

SignaIP软件预测显示，BoaBKI1蛋白不存在明显的信号肽，属于非分泌性蛋白；softberry-ProtComp软件对其进行亚细胞定位预测，结果显示BoaBKI1蛋白定位于细胞质或细胞膜。所得氨基酸序列在NCBI网站上进行保守结构域分析，没有推定的保守结构域被检测到。

使用NCBI-BLASTp程序进行芥蓝BoaBKI1氨基酸序列（图3）的同源性比对，结合DNA-man软件进行分析（图4），多重序列比对结果显示：芥蓝BKI1蛋白与甘蓝的序列一致性达到100%，与同属植物欧洲油菜、芜菁的一致性超过97%，与同为十字花科植物的拟南芥、亚麻芥和荠菜的一致性超过75%，与葡萄、菜豆、陆地棉和毛果杨等植物的一致性不低于30%。

图3 BoaBKI1基因编码区及氨基酸序列Figure 3 CDS and amino acid sequences of BoaBKI1 gene

图4 BoaBKI1与其他植物BKI1蛋白的氨基酸序列比对Figure 4 Amino acid sequence alignment of BoaBKI1 protein with other BKI1 proteins

在同源性分析的基础上，将来自33种不同植物的BKI氨基酸序列以距离矩阵法中的邻接法（neighbor-joining method）做N-J聚类分析，构建进化树（图5）。结果显示，33种植物首先分为两个大的类群，一类为大叶藻、蒺藜苜蓿、蓟和鹰嘴豆等较低等植物，另一类为其它草本及木本植物。在草、木本植物的大类群中又可以分为两类，一类为白花菜目的十字花科和白花菜科植物，另一类为除白花菜目的其他草、木本植物。白花菜目植物中，芥蓝首先与9种十字花科植物聚在一小类，其中又与同为芸薹属蔬菜的甘蓝、欧洲油菜以及芜菁的距离更近，且与甘蓝和欧洲油菜在同一分支。

2.3 BoaBKI1基因表达分析

2.3.1 BoaBKI1在不同时期的表达

芥蓝BoaBKI1基因在萌动种子期、子叶期、真叶期和成熟叶片期均有表达，并且在整个发育时期中，呈现先上升后下降的趋势，其中真叶期表达量最高，其次为子叶期和成熟叶片期，萌动种子期的表达量最低（图6）。

2.3.2 BoaBKI1在成熟期不同器官的表达

图6显示BoaBKI1基因在芥蓝不同器官中均有表达，其中在叶片、叶柄中的表达水平明显高于其他器官，在果荚中的表达量次之，在幼果、根系中的表达量较低，在花序、花薹中表达水平最低。

图6 芥蓝不同发育时期和不同器官中BoaBKI1的表达Figure 6 Expression of BoaBKI1 in different developmental stages and organs of Chinese kale

2.3.3 BoaBKI1在花器官的表达

对芥蓝花器官中BoaBKI1的表达水平进行分析后发现，BoaBKI1基因在花蕾和开放花朵的各组织中均有表达。花蕾中花瓣和雌蕊的BoaBKI1表达水平最高，其次是雄蕊，萼片中表达水平最低。开放花朵中雌蕊表达量最高，其次是雄蕊和花瓣，萼片中表达量最低。伴随花朵开放，BoaBKI1基因在各组织中表达水平均出现上调，其中雌蕊和雄蕊上调趋势最为显著（图7）。

图7 芥蓝花器官不同组织BoaBKI1的表达量Figure 7 Expression of BoaBKI1 in different tissues of flower organs in Chinese kale

3 讨论

本试验克隆获得了芥蓝油菜素甾醇相关基因BoaBKI1的cDNA序列，同源序列比对及进化树分析表明BoaBKI1与其他植物的BKI1蛋白在氨基酸序列上有较高的一致性，与同为芸薹属的甘蓝和欧洲油菜在同一分支，与苹果等木本植物在不同分支，即BKI1蛋白在同科属植物间较为保守，在亲缘关系较远的不同属植物间较不保守。据亚细胞定位预测结果显示，BoaBKI1蛋白定位于细胞质或细胞膜，这与拟南芥AtBKI1在烟草上的定位结果相同[20]，由此可推测该基因可能在细胞质或细胞膜上参与BR信号途径的调控。

基因表达分析发现，BoaBKI1基因在芥蓝不同发育时期均有表达。其中，真叶期表达量最高，子叶期次之，萌动种子期的表达量最低；在芥蓝不同器官中也均有表达，其中在叶片、叶柄中的表达水平明显高于其他器官，在果荚中的表达量次之。Wang X.L.等[21]研究了AtBKI1在拟南芥幼苗中的表达情况，发现AtBKI1在两周大幼苗叶片、叶柄和茎尖中的表达量高，在根中的表达量次之，果荚中的最低，这与我们的试验结果基本一致。刘彩霞等[22]在对甘蓝型油菜BRI1的研究中发现，各时期及器官中BRI1表达情况为四叶一心时期的叶中最高，根中较低。此外，郝岭等[23]的研究进一步表明了玉米幼嫩组织中BRI1表达量高，它能促进叶片变大与叶柄伸长。在以往研究中发现，BR信号转导途径中BRI1与BKI1的密切关联，它们在植物体内的相互作用具有高度特异性，且两者在植物中的表达规律有相似之处，这显示了BRI1和BKI1在一些组织中共表达的可能性[21]。种子形成时，为提供大量营养物质促进种子成熟，植物体内的BR激素合成增加，诱导BRI1-BAK1蛋白质受体合成[22]，此时，活化的BRI1将BKI1磷酸化，并使其从质膜上脱离并进入细胞质[12]，致使BKI1在果荚中的表达量较低。至于萌动种子期，推测是因为种子萌发主要是BR与其他植物激素互作促进的[24]，且该时期BRI1的表达量较低[22]，BKI1可能与BRI1的结合并不剧烈而使得表达量较低。

BoaBKI1基因在花蕾和开放花朵的各组织中均有表达。在这两个花器官中，花蕾中花瓣BoaBKI1的表达水平最高，开放花朵中则是雌蕊，而两者中表达量最低的都是萼片。花瓣的展开是由花蕾到开放花朵转变的明显标志，为了促进花朵的开放，一些BR信号通路上的基因如BRI1的表达有所上升[25]，相应的，为了使BRI1的表达量维持在一定水平[12]，花瓣中BKI1表达量也会随之增加。BR是由花粉提纯而来的活性物质，可通过降低开花抑制因子的转录水平来促进花朵的开放[26]，从花蕾到花朵开放，雄蕊产生花粉的速度增加，花粉的活力逐渐增强，此时的雄蕊中BR储备丰富，造成了大部分BKI1与BRI1脱离。随着花朵的逐渐开放，在雌蕊中BR含量可能会有略微增加，BRI1的表达量受到BR刺激也会有所增加，Nie S.M.等[27]发现过表达BRI1的番茄株系中花变大，花瓣和花柱均变长，花柱变长后，可能会阻碍花粉进入子房，造成结实率下降，为了避免这一现象，雌蕊中的BKI1的表达量会大幅增加[21]，从而与大部分BRI1结合，使得结实率维持在一定水平。BoaBKI1在萼片中表达量最低，可能是BR信号通路主要在雄蕊、雌蕊和花瓣这几个组织中起作用，从而促进开花受精形成种子。

4 结论

本试验成功克隆了芥蓝BR信号传导途径中的受体激酶抑制剂BoaBKI1，并对其进行生物信息学分析，接着通过对BoaBKI1进行时空表达分析，发现该基因在芥蓝的不同时期、器官和组织中都有一定程度的表达，说明该基因在芥蓝的不同生长发育过程中均起到作用。所得结果为研究芥蓝BoaBKI1的功能和在BR信号传导过程中的调节机制奠定了基础。