广西猫杯状病毒全基因组序列测定及其遗传进化分析

丁仰保，何剑桥，刘林林，余良政，崔柏杨，周华波，韦祖樟，欧阳康，黄伟坚，陈 樱

（1.家畜传染病与分子免疫学实验室，广西大学动物科学技术学院，南宁 530004；2. 南宁市华波宠物医院，南宁 530004）

猫杯状病毒（Feline calicivirus, FCV）属于疱疹病毒属，单股正链RNA病毒，主要引起猫科动物上呼吸道疾病及口腔溃疡等主要临床症状[1-2]。FCV具有高度流行趋势，自1957年Fastier分离得到首株FCV以来，研究人员陆续从家猫[3]、老虎以及猎豹等猫科动物中成功分离得到多株FCV[4]，并且还从患有腹泻症状的狗中检测到FCV[5]。由于FCV毒株的不断变异，1998年美国的Pedersen等[6]首次报道了FCV相关的致死性全身系统性疾病（Virulent systemic disease FCV, VS-FCV），除表现为上呼吸道疾病等常规临床症状外，感染猫还出现不同程度的皮肤水肿、发热、溃疡性皮炎、厌食和黄疸，死亡率高达50%；2013年，意大利的Battilani等[7]在一例免疫过FCV的死亡宠物猫中也分离得到一株VS-FCV毒株；2015年，刘永相等[8]首次发现虎VS-FCV。可见，VSFCV毒株已经在世界上许多国家和地区出现，并且早期疫苗株已经不能够提供足够的保护，这严重危害到了宠物猫等猫科动物的生命安全[9-10]。

FCV全基因组由3个开放性阅读框（open reading frame, ORF）组成，ORF1基因主要编码非结构蛋白前体，ORF2和ORF3基因分别编码结构蛋白VP1和次要结构蛋白VP2[11]。其中，ORF2基因编码的结构蛋白（VP1），按功能域划分为A、B、C、D、E和F 6个区。A区域利用蛋白酶切割功能形成成熟的结构蛋白；B、D、F区相对比较保守；C和E区变异性较大，特别是E区包含大部分的抗原线性表位和鉴别VS-FCV的特征性氨基酸突变位点，变异最为明显，也是早期疫苗免疫失败的重要原因[12]。因此，了解FCV流行病学特征及其遗传进化规律，将为今后防控FCV和筛选候选疫苗株提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 样品来源及处理 2018年3月至2019年9月，从广西地区采集疑似FCV临床症状的猫鼻拭子59份。患病猫主要为呼吸道感染，伴有发热（体温为38.5℃～40.1℃），并出现口腔溃疡、流涎和口眼鼻分泌物增多等主要临床症状。将RT-PCR鉴定为阳性的样品，在旋涡振荡1 min后，10 000×g、4℃离心4 min，弃棉签，保存在-80℃已备接毒用。

1.2 细胞和主要试剂 猫肾细胞（crandell feline kidney cells, CRFK）由中国军事科学院惠赠，本实验室保存。Primestar Mix购自TaKaRa公司；Nucleic Acid Purification Kit购自康宁公司；dNTP、RNasin酶抑制剂、M-MuLV Reverse Transcriptase（200U/L）购自宝生物（大连）有限公司采购；DNA胶回试剂盒购自天根生化科技（有限）公司；DMEM培养基以及胎牛血清购自Gibco公司。

1.3 病毒分离和透射电镜分析 将鉴定为阳性的样品进行过滤除菌，接种在长至90%左右的单层CRFK细胞，37℃培养48 h，每12 h观察是否有细胞病变（cytopathic effect, CPE），当有明显CPE时，取细胞上清液进行3轮空斑纯化，将纯化的病毒送塞维尔公司进行透射电镜分析，其余冻存在-80℃备用。

1.4 病毒RT-PCR鉴定 按照Nucleic Acid Purification Kit试剂盒说明书提取病毒总RNA。以P6引物（5'-CCCTGGGGTTAGGCGCWG-3'）作为反向引物[13]，并按照AMV反转录酶使用说明书进行反转录。具体体系如下：5×Buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP mix 1 μL，P6（25 pmol/L）0.5 μL，M-MLV反转录酶0.25 μL，RNasin抑制剂0.25 μL，RNA 8 μL。42℃反转录1 h。根据Abd-Eldaim[14]设计的引物和程序，对纯化的病毒细胞上清液进行鉴定。

1.5 病毒全基因组扩增和序列拼接 根据何平等[10]先前设计的引物稍作修改，对获得的FCV毒株进行全基因组扩增，运用Lasergene DNAStar 7.1中的SeqMan软件对获得的分段基因进行序列拼接，并通过NCBI（BLAST，megablast；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行检索。扩增程序为：98℃预变性2 min；98℃变性15 s，57℃退火15 s，72℃延伸1 min 30 s～3 min不等，共30个循环；72℃延伸10 min。胶回收产物送广州华大生物技术公司进行测序。

1.6 构建遗传进化树 从GenBank上下载其他50株FCV的ORF2基因序列，运用MEGA6.0 beta软件，通过邻接法（1000个重复）构建遗传进化分析树，并分析其序列特征。

2 结果

2.1 病毒分离情况 将鉴定为阳性的29份鼻拭子样品接种单层CRFK细胞后，24 h内细胞出现皱缩、变圆，呈串珠状的典型细胞病变效应（图1A）。通过RT-PCR鉴定，结果表明，细胞上清液能成功扩增获得550 bp左右的目的片段，与预期结果相符合（图1B）。通过三轮空斑纯化，将细胞上清液浓缩进行电镜鉴定，结果显示该病毒粒子的衣壳由呈中央凹陷的杯状壳粒构成，衣壳呈正二十面体，直径为30～40 nm，符合FCV病毒粒子的特征（图1C），因此将该分离株命名为NN01-19。

图1 NN01-19株的分离鉴定Fig.1 Isolation and identification of NN01-19 strain

2.2 病毒全基因组扩增和序列拼接 经琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果发现扩增获得基因片段（G1片段为1332 bp，G2片段为1947 bp，G3片段为2765 bp，G4片段为2288 bp）与预期大小相符（图3）。将四个片段进行序列拼接，发现本研究获得的NN01-19分离株基因组全长7709 bp，其中，5'UTR依旧高度保守，ORF1的长度为5292 bp（20-5311 bp），ORF2为2010 bp（5314-7323 bp），ORF3为321 bp（7319-7640 bp）。ORF3起始密码子与ORF2的终止密码子有4个核苷酸重叠，与以前的研究结果一致，而且3'UTR延伸到7709个碱基。

图2 NN01-19毒株全基因组扩增图Fig.2 Amplification of complete genome of NN01-19 stain by RT-PCR

2.3 ORF2基因的遗传进化分析 将ORF2基因与国内外代表毒株进行比较分析并构建遗传进化树，结果发现NN01-19分离株与东北地区分离株FCV-JL4的核苷酸和氨基酸同源性分别高达86.8%和93.1%，与2013年分离的广西早期毒株GX01-13的同源性仅为77.9%和86.5%，并且与疫苗株的同源性也仅为76.3%～77.2%和87.0%～87.4%（表1）。遗传进化树分析可知，NN01-19与FCV-JL4以及GX01-13均属于GI株群，与FCV-JL4处于同一分支，但是与GX01-13和疫苗株遗传距离却相对较远，均不在同一个遗传进化分支上（图3A和3B）。结果表明，FCV变异程度较大，并且分布也不具有明显的地域特征。

表1 NN01-19分离株与代表株之间的同源性分析Table 1 Homology of ORF2 gene between NN01-19 and representative strains

图3 ORF2基因的核苷酸和氨基酸遗传进化树（A为核苷酸遗传进化树, B为氨基酸遗传进化树)Fig.3 Phylogenetic trees based on nucleotides and amino acids of ORF2 gene（A and B means phylogenetic tree based on nucleotides and amino acids, respectively)

2.4ORF2D和E区抗原线性表位分析 本研究以F9疫苗株为参照株，其抗原线性表位为标准，通过与广西早期分离株GX01-13的ORF2D和E区进行比较分析发现（图4），D区抗原线性表位依旧高度保守；E区的抗原线性表位则发生高度变异，与GX01-13相比，NN01-19新增了T448A、T450G、G451Q和T454S 4个抗原突变位点。

图4 ORF2 D和E区抗原线性表位分析图谱Fig.4 Linear epitope analysis of antigen in D and E regions of ORF2

2.5 VS-FCV特征性氨基酸分析 本研究以Foley J等[15]对E区分析的具有VS-FCV突变特征的氨基酸位点为依据，将分离毒株与早期分离株GX01-13和16株VS-FCV毒株VP1蛋白的部分超变区序列（426-461 aa）进行比较。结果发现，NN01-19在430、448和452位点发生突变，其中只有V430T符合VS-FCV氨基酸位点特征（图5）。

图5 VP1蛋白 部分E区的氨基酸比较图Fig.5 Comparison of amino acid sequences of partical E region in VP1 protein

3 讨论

在过去40年的时间里，FCV被看做猫的重要病原之一。由于该病毒RNA聚合酶的校正功能的缺乏，导致其基因组频繁变异，甚至在出现VSD毒株感染时，疫苗失去保护力。随着近年来对FCV的不断监测，我们发现广西地区FCV流行呈上升趋势。在对感染FCV猫进行统计分析，我们发现所有年龄阶段的猫都能感染，1-3月龄的幼猫相对较易感，感染率高达41.4%（12/29）（数据未出示）。有报道称，成年猫感染后表现更为严重，甚至致死，特别是VS毒株的出现可能改变了主要保护抗原的蛋白结构而导致免疫逃逸[16]。为深入了解FCV流行规律及其变异情况，本研究对新分离的FCV NN01-19毒株进行了遗传进化和致病性氨基酸位点的分析。

FCV毒株分为GI和GII两个株群，其中GI群以高致病性的Kaos、Air和UTCVM-NH2等国外的VSFCV毒株为主，GII株群则为经典株群，其中，大部分中国的FCV毒株均属于GII株群[17]。有趣的是，通过ORF2核苷酸和氨基酸的遗传进化分析发现，本研究分离的广西毒株NN01-19并非属于GII经典株群，而是与广西早期毒株GX01-13同属GI高致病性群体。同时，NN01-19和GX01-13虽同属一个株群，但核苷酸和氨基酸同源性却相对较低，分别仅为77.9%和86.5%，这也再一次证实了FCV随着时间推移，其基因组的变异程度较大。此外，与疫苗株相比，本研究分离的毒株仍旧与其不在同一分支，而且同源性也较低，这意味着当前疫苗的使用可能会造成猫群的免疫失败。另外，通过分析NN01-19全基因组特征，我们发现该毒株的确发生了较大变异，与早期分离株GX01-13相比，NN01-19 ORF3基因3'端的非编码区延伸到7709个碱基，这也与大多数报道的毒株均不相同（数据未显示）。2011年，Clotilde等[18]证明3'端非编码区可以与核仁素（一种普遍存在的多功能核仁穿梭磷蛋白）相互作用，广泛参与病毒的翻译和复制，这些相互作用通常有利于提高其宿主特异性和组织嗜性，该毒株3'端的变异是否具有相同的有利影响有待进一步研究。除此之外，FCV VP1蛋白变异最大的E区部分，含有病毒大多数的抗原线性表位，它可作为流行病学调查最有力的工具[19]。本研究将3轮空斑纯化的病毒分别进行E区的基因扩增，在3次扩增结果一致的情况下，对其E区进行序列分析，结果表明，与早期分离株GX01-13相比，NN01-19新增了T448A、T450G、G451Q和T454S四个抗原突变位点，同一地区不同时期的毒株在短短几年内，其抗原位点便发生了诸多变异。早期疫苗为何不能再提供足够的防护，其毒株抗原的不断变异可能在其中占据重要原因。与此同时，更严重的可导致恶性全身系统性疾病的VSFCV毒株也在免疫选择压力下开始出现和流行，全身多器官病变和高死亡率为其主要特征[20-21]。有研究发现，VS-FCV具有特征性氨基酸位点，Foley等[15]对E区具有VS-FCV突变特征的氨基酸位点进行比较分析，发现V430T、T438V、N443S、A448K、A452E、D455M 和 K458S与其致病性相关。本研究发现，相比早期分离株GX01-13毒株，NN01-19毒株发生了3个位点的突变，其中就包含致病性突变位点（V430T），该位点的改变是否会增强该毒株的致病性，仍需要进一步验证。

本研究将近期分离的毒株与早期毒株进行了对比分析，结果发现经历几年的遗传进化，FCV基因组发生了较大变异，虽然在同一个基因群，但是核苷酸同源性仅为77.9%。有趣的是，该毒株的超变区（E区）出现了3个特征性氨基酸位点的改变，其中430位点氨基酸（V430T）的突变，符合致病性氨基酸突变特点，为后期验证其致病性提供了科学依据。总之，不断加强对FCV的监测，并掌握其流行病学规律和分子特征，将为今后筛选疫苗候选毒株奠定坚实的基础。