A型塞尼卡病毒与O型、A型、亚洲I型口蹄疫病毒多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

施开创，谢守玉，赵 晶，莫胜兰，刘惠心，尹彦文，司红彬，屈素洁，陆文俊，冯淑萍，粟艳琼

（1.广西动物疫病预防控制中心，南宁 530001；2.广西大学动物科学技术学院，南宁 530005）

A型塞尼卡病毒（Senecavirus A, SVA），曾用名塞尼卡谷病毒（Seneca vally virus, SVV），属于小RNA病毒科塞尼卡病毒属[1]。2007年，位于加拿大中南部的一家猪场发生原发性水疱病（porcine idiopathic vesicular disease, PIVD），病猪的鼻镜、蹄冠等部位出现水疱，并伴发高热等症状。针对口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus, FMDV）、猪水疱病病毒（Swine vesicular disease virus, SVDV）、水疱性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus, VSV）及猪水疱疱疹病毒（Vesicular exanthema of swine virus, VESV）的病原筛查结果均为阴性，最终SVA被证实是该病的病原[2]。随后，美国、巴西、中国、哥伦比亚、泰国、越南等国家相继报道SVA感染猪群发病[3-8]，在世界各国呈迅速蔓延之势。SVA的临床症状在成猪主要表现为厌食、发烧，口腔、鼻镜及蹄部出现水疱。产房仔猪，尤其是1日龄～4日龄的新生仔猪，感染后出现昏睡、皮肤充血、腹泻、神经症状及突然死亡[9-10]。SVA发病率因猪群不同生长阶段而异，断奶仔猪的发病率为0.5%～5%，育肥猪及后备猪的发病率为5%～30%，而新生仔猪的发病率可高达70%、死亡率可达15%～30%[11]。自2015年我国首次在广东省报道SVA感染猪群后，现已蔓延至湖北、黑龙江、福建及河南等多个省份[12-14]，造成巨大的经济损失。由于SVA与FMDV感染猪群的临床症状、病理变化极为相似，因此临床上难以区分，需借助实验室检测才能鉴别诊断。当前，国内外已有学者建立了FMDV不同血清型以及SVA、FMDV鉴别检测的多重荧光定量RT-PCR方法。谢彩华等[15]建立了FMDV通用型和A型二重实时荧光RT-PCR检测方法，Jamal等[16]建立了O型、A型及亚洲I型FMDV多重荧光定量RT-PCR检测方法，Tam等[17]建立了O型、A型、亚洲I型、C型、SAT1型、SAT2型、SAT3型FMDV多重荧光定量RT-PCR检测方法，Wang等[18-19]建立了SVA和FMDV双重荧光RT-PCR检测方法。但是，迄今尚未见区分检测SVA与O型、A型、亚洲I型FMDV多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法的报道。本研究针对SVA 3D基因、O型、A型及亚洲I型FMDV VP1基因，设计特异性引物和TaqMan探针，经优化各种反应条件，成功建立了同时检测并区分SVA与O型、A型、亚洲I型FMDV的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法，为相应病原的鉴别检测提供了特异、敏感、高效的检测方法。

1 材料与方法

1.1 病毒株与临床病料样品 SVA分离株（GD株）由扬州大学惠赠；FMDV O型疫苗株（O/Mya98/XJ/2010）、亚洲I型疫苗株（JSL株）购自中牧实业股份有限公司兰州生物药厂；A型疫苗株（AF/72株）购自中农威特生物科技股份有限公司；猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRSV）疫苗株（TJM-F92株）、猪瘟病毒（Classical swine fever virus, CSFV）疫苗株（C株）、伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus, PRV）疫苗株（Bartha-K61株）、猪细小病毒（Porcine parvovirus, PPV）疫苗株（N株）、猪圆环病毒2型（Porcine circovirus 2, PCV2）疫苗株（SX07株）、猪圆环病毒3型（Porcine circovirus 3, PCV3）分离株（GX02-2018株）均由本实验室保存。30份疑似样品（淋巴结、水疱液、痂皮等）于2019年采自广西各地猪场临床疑似病猪。

1.2 主要试剂 Mini Plasmid Kit质粒抽提试剂盒、通用型DNA纯化回收试剂盒、E. coli DH5α感受态细胞购自天根生化科技（北京）有限公司；MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver. 5.0病毒核酸提取试剂盒、PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit cDNA合成试剂盒、pMD18-T载体、EcoRⅠ内切酶及Hind Ⅲ内切酶、Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.3 引物及TaqMan探针 根据GenBank登录的SVA（NC_011349）、O型FMDV（KR401154）、A型FMDV（KT968663）及亚洲I型FMDV（KR073010）参考毒株基因序列，针对SVA3D基因以及O型、A型、亚洲I型FMDVVP1基因，分别设计特异性引物及TaqMan探针（见表1）。引物和探针由宝生物工程（大连）有限公司合成。

表1 本研究所用引物及探针Table 1 Primers and probes used in this study

1.4 重组质粒标准品的制备 取SVA GD株、FMDV O型O/Mya98/XJ/2010株、A型AF/72株、亚洲I型JSL株病毒液200 µL，采用试剂盒提取总RNA，反转录为cDNA，分别作为模板，应用设计的4对引物进行PCR扩增。回收、纯化PCR产物，连接pMD18-T载体，转化DH5α感受态细胞，筛选阳性菌落并扩大培养，抽提质粒，进行PCR、酶切及测序鉴定。鉴定正确的重组质粒分别命名为pSVA-3D、pO-VP1、pA-VP1、pAsia I-VP1，作为阳性标准品。用紫外分光光度仪测定4种重组质粒标准品的浓度后，按照计算公式：拷贝数（copies/mL）=6.02×1023拷贝数/摩尔×（浓度）/（MW g/moL），分别将4种质粒换算为拷贝数。

1.5 反应条件的优化及标准曲线的建立 将4种重组质粒标准品pSVA-3D、pO-VP1、pA-VP1、pAsia I-VP1作为模板，应用4对特异性引物和TaqMan探针，在同一体系中进行TaqMan荧光定量PCR扩增，采用矩阵法分别对退火温度（55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃）、引物浓度（终浓度分别为0.2、0.3、0.4、0.5 pmol/µL）及探针浓度（终浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 pmol/µL）进行优化，获得TaqMan荧光定量PCR最佳反应条件。将4种重组质粒标准品混合后10倍系列稀释为2.50×108copies/µL～2.50×101copies/µL，作为模板，按照优化的TaqMan荧光定量PCR条件进行扩增，绘制扩增曲线和标准曲线。

1.6 特异性试验 取SVA GD株、FMDV O/Mya98/XJ/2010株、FMDV AF/72株、FMDV JSL株、PRRSV TJM-F92株及CSFV C株病毒液，按照试剂盒说明书提取总RNA，反转录成cDNA；取PRV Bartha-K61株、PPV N株、PCV2 SX07株及PCV3 GX02-2018株病毒液，提取总DNA。将上述cDNA和DNA作为模板，以4种重组质粒标准品混合物为阳性对照、灭菌ddH2O为阴性对照，应用所建立的多重TaqMan荧光定量RT-PCR进行扩增，验证该方法的特异性。

1.7 敏感性试验 将4种重组质粒标准品pSVA-3D、pO-VP1、pA-VP1、pAsia I-VP1混合后10倍系列稀释，取终浓度为2.50×108copies/µL～2.50×100copies/µL的质粒混合物作为模板，应用所建立的TaqMan荧光定量PCR进行扩增，验证该方法的敏感性。

1.8 重复性试验 将4种重组质粒标准品pSVA-3D、pO-VP1、pA-VP1、pAsia I-VP1混合后10倍系列稀释，取3个浓度梯度（终浓度分别为2.50×107copies/µL、2.50×105copies/µL、2.50×103copies/µL）混合物作为模板，应用所建立的TaqMan荧光定量PCR进行扩增，验证该方法的重复性。组内重复性试验时，重复5次反应；组间重复性试验时，重复5次反应，间隔1周进行。

1.9 多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法的应用 取30份临床疑似样品，用灭菌剪刀将淋巴结、痂皮等组织样品剪成小块，放入灭菌离心管中，加入适量（W/V，1∶4）pH7.2 PBS溶液，反复冻融3次。放置病料磨碎仪中研磨至糜状，12 000×g离心3 min，取200 µL上清液用于提取总RNA，反转录成cDNA，应用本研究建立的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法进行检测。同时，参考李秀博等[20]建立的SVA TaqMan荧光定量RT-PCR方法对SVA进行检测，按照国家标准《口蹄疫诊断技术》（GB/T 18935-2018）对O型、A型、亚洲I型FMDV进行检测，计算上述方法和标准与本研究所建立方法对SVA与O型、A型、亚洲I型FMDV检测结果的符合率。

2 结果

2.1 重组质粒标准品的制备 提取SVA以及O型、A型、亚洲I型FMDV病毒液的总RNA，反转录成cDNA后作为模板，应用特异性引物进行PCR扩增，获得SVA 3D基因（70 bp）以及O型（111 bp）、A型（64 bp）、亚洲I型（71 bp）FMDV VP1基因的目的片段，与预期结果一致。回收PCR产物、连接、转化，阳性菌落扩大培养后抽提质粒，经PCR、酶切及测序鉴定正确后，获得的重组质粒分别命名为pSVA-3D、pO-VP1、pA-VP1、pAsia I-VP1。测定其浓度并换算成拷贝数，分别为3.72×1010、2.44×1010、2.37×1010、2.60×1010copies/µL，作为质粒标准品。

2.2 多重TaqMan荧光定量RT-PCR最佳反应条件的确定 经优化后，获得多重TaqMan荧光定量RT-PCR最佳反应体系（20 µL）：Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）10 µL，SVA、A型及亚洲I型FMDV特异性上、下游引物（20 pmol/µL）各0.5 µL，探针（20 pmol/µL）各0.4 µL，O型FMDV特异性上、下游引物（20 pmol/µL）及探针（20 pmol/µL）各0.3 µL，模板2 µL， ddH2O 2.9 µL。扩增程序为：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，58℃退火34 s，40个循环；同时收集荧光信号。阴性对照的检测结果应无特定扩增曲线，且Ct值＞35.0或无，阳性对照Ct值≤35.0，且出现特定的扩增曲线，判定检测结果成立。在检测结果成立的前提下，若样品检测结果Ct值≤35.0，且出现特定的扩增曲线，判定为阳性；否则，判定为阴性。

2.3 多重TaqMan荧光定量RT-PCR标准曲线的建立 将4种重组质粒标准品pSVA-3D、pO-VP1、pA-VP1、pAsia I-VP1混合后10倍系列稀释成浓度为2.50×108～2.50×101copies/µL，作为模板，进行多重荧光定量PCR，获得多重TaqMan荧光定量RTPCR扩增曲线及标准曲线（图1）。结果显示，4条标准曲线的相关系数R2均在0.998以上。结果表明，4种质粒标准品的初始浓度与Ct值之间呈现良好的线性关系。

图1 多重TaqMan荧光定量RT-PCR扩增曲线（A、B、C、D）及标准曲线（E）Fig. 1 Dynamic curves (A, B, C, D) and standard curves (E) of the multiplex TaqMan real-time RT-PCR

2.4 特异性试验 以pSVA-3D、pO-VP1、pA-VP1、pAsia I-VP1 4种重组质粒标准品，SVA、FMDV（O型、A型、亚洲I型）、CSFV、PRRSV的cDNA及PRV、PPV、PCV2、PCV3的DNA为模板，进行多重TaqMan荧光定量RT-PCR扩增。结果，仅有4种重组质粒标准品、SVA、FMDV（O型、A型及亚洲I型）的cDNA出现扩增曲线，且Ct值小于35个循环，检测结果为阳性；而其他病毒检测结果均为阴性（图2）。表明该方法具有较强的特异性。

图2 多重TaqMan荧光定量RT-PCR特异性试验Fig.2 Dynamic curves of the multiplex TaqMan real-time RT-PCR for specificity analysis

2.5 敏感性试验 将4种重组质粒标准品pSVA-3D、pO-VP1、pA-VP1、pAsia I-VP1混合后10倍系列稀释，作为模板，用于多重TaqMan荧光定量RT-PCR的敏感性试验。结果显示，Ct值在35个循环以下时，pSVA-3D、pO-VP1、pA-VP1、pAsia I-VP1的检出下限分别为2.50×101、2.50×102、2.50×102、2.50×102copies/µL（图3）。表明该方法敏感性较高。

图3 多重TaqMan荧光定量RT-PCR敏感性试验Fig. 3 Dynamic curves of the multiplex TaqMan real-time RT-PCR for sensitivity analysis

2.6 重复性试验 取4种重组质粒标准品2.50×107、2.50×105、2.50×103copies/µL混合物，用于多重TaqMan荧光定量RT-PCR的重复性试验。结果，组内与组间重复性试验Ct值的变异系数均小于2%（表2）。表明该方法重复性良好。

表2 多重TaqMan荧光定量RT-PCR重复性试验Table 2 Repeatability analysis of the multiplex TaqMan real-time RT-PCR

2.7 多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法的临床应用应用所建立的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法，对30份临床疑似样品进行检测，结果检出SVA阳性6份，阳性率为20.0%；检出O型FMDV阳性21份，阳性率为70.0%；未检出A型、亚洲I型FMDV。同时，应用李秀博等[20]建立的SVA荧光定量RT-PCR方法进行检测，检出SVA阳性6份（20%）；应用国家标准《口蹄疫诊断技术》（GB/T 18935-2018）进行检测，检出O型FMDV阳性21份（70%）；与本研究所建立的方法对SVA以及O型、A型、亚洲I型FMDV检测结果的符合率为100%。

3 讨论

在我国，广东省2015年首次报道SVA感染发病猪[5]，此后相继在湖北、黑龙江、福建及河南等多个省份暴发由SVA感染引起的PIVD[12-14]。至于猪FMD，目前我国猪群存在O型、A型FMD，以O型为主[21]，而亚洲I型FMD也曾在我国发生。2005年5月至2018年12月我国共向OIE通报FMD疫情162次，其中O型79次，A型37次，亚洲I型46次；但亚洲I型自2011年以后国内未发生疫情、未发现监测阳性样品，2018年起亚洲I型FMD在我国免疫退出（农业农村部第2635号公告）。但是，我国周边的一些国家仍有O型、A型及亚洲I型FMD发生[22-25]，随时有传入我国的风险。由于SVA和O型、A型FMDV在我国仍时有发生，而亚洲I型随时有从周边国家传入的威胁，因此对SVA和O型、A型、亚洲I型FMDV的防控丝毫不可松懈。由于SVA和FMDV所致疫病的临床症状、病理变化极为相似，难以区分，给临床诊断造成很大困难，本研究借助实验室分子诊断技术，利用荧光定量RT-PCR方法特异、灵敏、高效等优点，针对SVA与O型、A型、亚洲I型FMDV，设计特异性引物和TaqMan探针，经优化反应条件，成功建立了鉴别检测上述病原的多重荧光定量RT-PCR方法，为实验室检测提供了有效的技术方法，具有重大的现实意义。所建立的方法与FMD诊断技术的国家标准、已发表文献中的SVA检测方法[20]，对临床疑似样品检测结果的符合率为100%，进一步验证了本研究所建立方法的可靠性、实用性。

应用本研究建立的方法对30份临床疑似样品进行检测，结果检出SVA阳性6份，阳性率为20%（5/30），检出O型FMDV 21份，阳性率为70%（8/30）；未检出A型及亚洲I型FMDV。检测结果证实了SVA在广西猪群的存在和流行，也表明了FMDV在广西的临床流行毒株仍以O型为主。国内其他学者也对临床病猪疑似样品进行了SVA和FMDV的检测，谢彩华等[15]检测来自河南省的123份临床疑似样品，结果FMDV检出阳性率为8.13%（10/123），其中A型FMDV检出阳性率为4.88%；刘健新等[26]检测来自广东省的124份临床疑似样品，结果SVA检出阳性率为3.2%；张志等[27]对2016-2018年从多个省份采集的病料进行SVA监测，结果SVA检出阳性率分别为14.6%、21.9%及22.6%；林彦星等[19]检测来自华南地区的116份临床样品（病猪内脏、水疱液、口腔拭子、粪便样品），结果SVA检出阳性率为6.03%（7/116）、FMDV检出阳性率为12.93%（15/116）。以上结果表明，我国猪群存在不同程度的SVA和FMDV感染。而我国周边国家FMD疫情不断，仅2018年全球就有45个国家向OIE通报口蹄疫疫情，亚洲地区报告的血清型包括O型、A型及亚洲I型，以O型分布最广，其中蒙古、不丹、泰国、越南发生了O型、A型口蹄疫，尼泊尔、阿富汗和伊朗发生O型、A型及亚洲I型口蹄疫[25]。因此，必须加强SVA和O型、A型、亚洲I型FMDV的监测和流行病学调查。本研究所建立的多重实时荧光RT-PCR方法，利用同一个反应即可快速地同时鉴别SVA以及FMDV不同血清型，大大缩短了检测周期；对SVA的检出下限达到2.50×101copies/μL，对O型、A型、亚洲I型FMDV的检出下限均达到2.50×102copies/μL，在临床感染和混合感染前期病毒含量很低时，本方法也能敏感、准确地检测和区分出来，有助于感染猪的及早筛查、精准拔除。因此，本方法具有很高的临床实用价值和应用前景。

总之，本研究针对SVA 3D基因以及O型、A型、亚洲I型FMDV VP1基因序列，分别设计特异性引物和探针，经过优化反应条件，成功建立了特异性强、敏感性高、重复性好的SVA与O型、A型、亚洲I型FMDV多重荧光定量RT-PCR鉴别检测方法，为临床上SVA与O型、A型、亚洲I型FMDV的鉴别检测及流行病学调查提供了特异、敏感、高效的检测方法。