山羊乳与牛乳配方乳粉的致敏性比较

姜玉池，赵怡晴，谢 奎，陈 成，车会莲，韩诗雯,*

（1.北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083；2.海普诺凯营养品有限公司，湖南 长沙 410000）

乳及乳制品含有蛋白质、脂肪、碳水化合物、矿物质及维生素等20多种人体所必需的营养物质，尤其是钙含量高，且钙磷比适宜，易被人体消化吸收。然而最常见的乳制品——牛乳，却是联合国粮食与农业组织和世界卫生组织公布的八大类常见过敏食物之一，常发生于3岁以下儿童。欧洲一项2000—2012年流行病学研究确定了欧洲地区牛乳过敏发病率高达6.0%[1]；加拿大10个省的调查结果显示牛乳过敏发病率为2.2%[2]。牛乳过敏临床症状以腹泻为主，并伴有皮肤瘙痒、湿疹、咽部水肿、流涕、喷嚏、鼻塞、喘息、哮喘等皮肤、胃肠道和呼吸系统症状[3]，严重影响了牛乳过敏患者的生活质量。牛乳过敏主要是由免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）E介导的超敏反应，初次进入机体的乳蛋白诱发B细胞产生特异性IgE抗体，并与肥大细胞、嗜碱性粒细胞等表面的FcεRI结合，使机体处于致敏状态；在激发阶段，耐受了胃液消化分解的乳蛋白通过小肠吸收进入免疫系统，与致敏肥大细胞表面的IgE抗体特异性结合，使表面的FcεRI活化，促使肥大细胞脱颗粒，释放出组胺等介质，引起体温下降、瘙痒、血管渗透性增加等过敏表征[4]。目前缓解食物过敏最有效的方法是规避过敏原，即避免食用牛乳及其相关制品，但这会影响机体获取蛋白质、钙等牛乳中丰富的营养素；也可选用深度水解乳蛋白的配方乳粉作为替代品，但往往失去了乳制品本身的口感和风味。因此，寻找一种具有丰富营养成分但致敏水平较低的替代乳制品是乳品工业发展所面临的一大挑战。

山羊乳是世界上饮用历史最早的动物乳，且其饮用人数最多。目前，世界上有113个国家或地区生产山羊乳，山羊乳产量约占总乳源的2%。山羊乳及其制品（包括奶酪和酸乳）具有味道鲜美、营养丰富、易消化等特点[5]，被视为乳品中的精品，近年来，其作为“奶中之王”受到越来越多的关注。目前研究表明，牛乳和山羊乳在化学特性、蛋白质组成等方面具有相似性。牛乳的pH值和酸度分别为6.63和0.13%，山羊乳的pH值和酸度分别为6.49和0.12%[6]；脱脂牛乳和脱脂羊乳的酪蛋白、乳清蛋白、β-乳球蛋白以及α-乳白蛋白含量均相近[7]。Lara-Villoslada等[8]在特应性小鼠模型中发现，山羊乳的免疫原性比牛乳的免疫原性更低。有研究发现，山羊乳喂养的婴儿肠道菌群中有益菌的比例更高，进而促进免疫系统发育，减少气道反应的发生[9]。Jirillo等[10]发现山羊乳可以调节炎性介质的产生，如人外周血单核细胞和多形核中性粒细胞中一氧化氮（NO）、白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），下调T辅助（T helper，TH）2型细胞的活化，通过维持免疫稳态而降低过敏反应。此外，不同来源乳蛋白之间可能会发生交叉反应，在一项对牛乳过敏患者的研究中发现仅50%的患者会与山羊乳产生交叉反应[11]，这可能为将来利用山羊乳替代牛乳降低过敏反应提供了可能。

为了系统比较山羊乳与牛乳的致敏性，研究两者之间的交叉反应性，本研究依据联合国粮食与农业组织和世界卫生组织公布的蛋白质潜在致敏性树状评估策略[12]对一种山羊乳配方乳粉和一种牛乳配方乳粉进行了致敏性评价，该评估策略已被广泛应用于食物蛋白和转基因食品外源蛋白的致敏性评价中[13]，能够有效评估食物蛋白的致敏性。此外，本研究还利用已确诊的牛乳过敏患者血清与山羊乳配方乳粉进行交叉反应性研究，为后续利用山羊乳配方乳粉作为替代乳降低牛乳过敏性疾病的发生提供可能。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

60只4～5周龄SPF级雌性BALB/c小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于中国农业大学东校区SPF级动物房（SYXK（京）2020-0052）。饲养环境温度维持在（22±1）℃，相对湿度稳定在（55±5）%，每12 h昼夜气流交替1次。所用饲料为商业化SPF级维持饲料，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。本研究中的动物实验已通过中国农业大学动物伦理委员会审查。

乳山羊乳配方乳粉和牛乳配方乳粉由海普诺凯营养品有限公司提供，两种乳粉加工工艺及所含添加剂种类一致，且符合GB 19644—2010《食品安全国家标准 乳粉》中各项要求。其中山羊乳配方乳粉中蛋白质含量为16.1 g/100 g，牛乳配方乳粉中蛋白质含量为18.6 g/100 g。

乙腈（质谱纯） 美国Fisher Chemical公司；胰蛋白酶（测序级） 美国Promega公司；甲酸（质谱纯）、碳酸氢铵（质谱纯）、二硫苏糖醇（分析纯）、碘乙酰胺（分析纯）、酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳清蛋白、牛血清白蛋白、乳铁蛋白、IgG和组胺酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测试剂盒 北京冬歌伟业公司；来源于猪胃黏膜的胃蛋白酶（＞3 200 units/mg蛋白）、霍乱毒素（cholera toxin，CT）佐剂、伊文思蓝 美国Sigma-Aldrich公司；小鼠抗人IgE、羊抗小鼠IgE、羊抗小鼠IgG1（均为辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记） 美国Abcam公司；BCA蛋白定量试剂盒 江苏康为世纪公司。

实验所用血清均来自河南新乡医学院。本研究所使用的人体血清样本已取得患者的知情同意。血清样本采集方法、贮存方法、研究方案及样本处理等均已获得中国农业大学人体研究伦理委员会的审核批准。血清来源的具体信息如下：

1#、2#、3#均为经过敏原检测后确定为非过敏人群的血液样本；4#：女，1岁，牛乳阳性（+）、鸡蛋白阳性（+）、黄豆弱阳性（+－）、海鱼组合（鳕鱼/龙虾/扇贝）弱阳性（+－）；5#：男，1岁，牛乳阳性（+）、牛肉阳性（+）；6#：女，7岁，牛乳（+－）、尘螨组合（屋尘螨/粉尘螨）（++）、霉菌组合（+－）。

1.2 仪器与设备

Ultimate3000毛细管高效液相色谱仪、电喷雾-组合型离子阱Orbitrap质谱仪、Varioskan LUX多功能酶标仪美国Thermo Fisher Scientific公司；5430低速高温离心机美国Eppendorf公司；WI88375小鼠肛温计 北京冀诺泰科技发展有限公司；DSHZ-300恒温水浴箱 江苏太仓医用仪器厂；DYCZ-24DN电泳仪 北京六一仪器厂；JY-ZY5电转仪 北京君意东方电泳设备有限公司；BX51T-PHD-J11显微镜 日本奥林巴斯公司。

1.3 方法

1.3.1 液相色谱串联质谱鉴定蛋白

为了比较两种配方乳粉中的蛋白质种类和主要过敏原含量，利用蒸馏水配制两种乳粉的蛋白溶液（质量浓度为5 mg/mL），经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和胰蛋白酶酶解进行前处理后进行液相色谱串联质谱（liquid chromatopraphy tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）检测。预柱（5 mm×300 μm，5 μm，100 Å）；Acclaim PepMap反相液相色谱（reversed-phase liquid chromatography，RPLC）C18分析柱（150 mm×150 μm，1.9 μm，100 Å）。流动相A为0.1%（体积分数，下同）甲酸+2%乙腈；流动相B为0.1%甲酸+80%乙腈。流速600 nL/min。每个组分分析时间为60 min。质谱原始文件使用Maxquant（v1.6.2.10）软件分别检索uniprot-Bos taurus和uniprot-Capra hircus数据。

1.3.2 体外模拟胃液消化

模拟胃液配制（参照农业农村部869号公告-2-2007）：将0.2 g氯化钠（NaCl）和83 mg胃蛋白酶溶于70 mL重蒸馏水，加入730 μL盐酸，并用盐酸调节pH值至1.2，加蒸馏水定容至100 mL。

按照BCA蛋白定量试剂盒说明书，将蒸馏水溶解的蛋白样品调整为同一质量浓度（5 mg/mL），参照农业部869号公告-2-2007，将模拟胃液分别与由两种乳粉配制的蛋白溶液按照19∶1（V/V）的比例混合，快速振荡混匀，置于37 ℃水浴中，计时。在0、15 s及2、30、60 min时间点取样，向模拟胃液中快速加入70 μL 0.2 mol/L碳酸氢钠溶液终止反应，再加入5×上样缓冲液，沸水煮5 min，进行SDS-PAGE。电泳结束后进行考马斯亮蓝染色、脱色，并拍照分析。

1.3.3 人体血清学方法评价蛋白样品致敏性

参照农业部2406号公告-5-2016，将待测蛋白样品充分溶解于包被缓冲液中，配制成质量浓度为10 μg/mL的样品。选取未检测出主要已知过敏原的健康人血清，作为阴性对照血清；选取已确诊对牛乳过敏的患者血清作为检测血清。通过间接ELISA法测定样品结合血清中IgE的能力。以450 nm波长下测得的光密度大于或等于阴性对照血清孔光密度平均值2 倍的样品为阳性结果。

1.3.4 BALB/c小鼠食物过敏模型

BALB/c雌性小鼠按体质量随机分成5组，分别为牛乳配方乳粉组（牛乳配方乳粉+CT佐剂）、山羊乳配方乳粉组（山羊乳配方乳粉+CT佐剂）、鸡蛋卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）阳性组（OVA+CT佐剂）、CT佐剂组（对照组）和阴性对照组（生理盐水），每组12只，适应性喂养1周后进行实验。实验期间，各组小鼠自由饮水和进食，每周称体质量并记录。实验开始第0、7、14、21、28天分别经口灌胃给予牛乳配方乳粉组、山羊乳配方乳粉组、鸡蛋卵清蛋白阳性组每只小鼠1 mg受试蛋白（吸附10 μg CT佐剂，用100 μL生理盐水稀释），CT佐剂组仅给予10 μg CT，阴性对照组接受相同体积（100 μL）的生理盐水。在实验第42天进行经口大剂量刺激，即灌胃5 mg牛乳配方乳粉、山羊乳配方乳粉受试蛋白或OVA蛋白，测试刺激前后小鼠肛温，观察并记录刺激后30 min内小鼠抓挠、活动降低、毛发直立、行走困难、呼吸缓慢等过敏症状。临床症状评价标准如下：没有症状记0 分；抓鼻子、挠头记1 分；眼睛、嘴巴周围浮肿，毛发竖立，活动减少或呼吸频率升高记2 分；哮喘、呼吸困难，嘴和尾巴周围苍白记3 分；刺激后抽搐或静止记4 分；死亡记5 分。按下式计算实验期间各组小鼠的食物利用率。

30 min后对实验动物进行眼部内眦采血，置于含乙二胺四乙酸二钾抗凝剂的离心管中，5 000 r/min、4 ℃下离心10 min，取血浆，保存于－20 ℃用于后续实验。

1.3.5 ELISA检测

ELISA检测包括2个实验。首先，为了确定两种配方乳粉中过敏原蛋白种类和含量，采用ELISA试剂盒测定牛乳配方乳粉和山羊乳配方乳粉中酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳清蛋白、牛血清白蛋白、乳铁蛋白和IgG共6种蛋白质的质量浓度。其次，为了确定不同致敏处理后BALB/c小鼠的过敏反应，利用ELISA试剂盒检测了小鼠血浆中组胺的水平。具体操作参照试剂盒说明书进行。

此外还依据ELISA原理利用羊抗小鼠IgE或羊抗小鼠IgG1检测了小鼠血浆中过敏原（牛乳配方乳粉或山羊乳配方乳粉或OVA）特异性IgE和特异性IgG1的水平，以反映两种配方乳粉的免疫原性。使用预先包被的96 孔板，每孔加入100 μL血浆于37 ℃下孵育2 h，洗涤3次后每孔加入100 μL HRP标记的羊抗小鼠IgE或羊抗小鼠IgG1，37 ℃下孵育1 h，洗涤3次后每孔加入90 μL 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB）显色液，于37 ℃下避光孵育15～30 min，最后加入50 μL终止液后轻轻混匀，5 min内用酶标仪测定各孔在450 nm波长下的光密度。

1.3.6 血管渗透性观察

伊文思蓝染色结果能够反映血管渗透性。大剂量刺激激发前，小鼠经尾静脉注射100 μL体积分数0.5%伊文思蓝溶液，再经口灌胃10 mg受试蛋白（牛/山羊乳配方乳粉和OVA蛋白），30～40 min后观察小鼠脚掌的渗出物颜色，并拍照记录。

1.3.7组织病理学观察

采用颈椎脱臼法处死小鼠，取各组小鼠肝脏、肺、脾脏和空肠放入质量分数10%甲醛溶液固定，对脏器进行脱水透明处理后，使石蜡浸入脏器中。将浸蜡后的组织置于融化的固体石蜡中。修正蜡块后进行切片，厚度一般为4～6 μm。脱蜡后使用苏木精-伊红（hematoxylineosin，HE）染色法染色或甲苯胺蓝染色，进行组织病理学观察。

1.3.8 Western blotting检测

40 μg牛乳配方乳粉或山羊乳配方乳粉蛋白样品上样至Tricine SDS-PAGE凝胶上进行电泳，80 V恒压下电转2 h，将蛋白条带印迹到硝酸纤维素膜上。用含5%牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA）的TBST缓冲液封闭1 h，加入1#、2#、3#混合血清（100∶1、V/V）于4 ℃下孵育过夜，TBST清洗6次（5 min/次）。按体积比8 000∶1加入抗兔IgG抗体、HRP标记抗体于37 ℃下孵育1 h，TBST清洗8次（5 min/次）。加入ECL化学发光剂孵育5 min显影曝光后分析。

1.4 数据处理与分析

生物信息学采用软件MaxQuant 1.6.2.10分析，其余数据利用GraphPad Prism 5.01软件进行独立样本t检验分析和单因素方差分析，结果以平均值±标准方差表示，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 两种配方乳粉中蛋白质种类鉴定

为了确定两种配方乳粉中蛋白质组成，通过LC-MS/MS分析得到牛乳配方乳粉和山羊乳配方乳粉中蛋白质数量和种类。其中牛乳配方乳粉中共鉴定出137种蛋白质，山羊乳配方乳粉中共鉴定出167种蛋白质。表1列出按照含量由高到低排名前10种蛋白质。

表1 牛乳配方乳粉和山羊乳配方乳粉中含量由高到低排名前10的蛋白质Table 1 Top 10 most abundant proteins in bovine and goat milk formula powder

2.2 乳品中已确定的主要过敏原水平分析

对IUIS过敏原命名数据库（IUIS Allergen Nomenclature）中公布的牛乳中过敏原（酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳清蛋白、牛血清白蛋白、乳铁蛋白和免疫球蛋白）进行定量分析，结果如图1所示，其中山羊乳配方乳粉中β-乳球蛋白（（103.46±2.86）μg/mL）和α-乳清蛋白（（43.15±2.08）μg/mL）水平显著低于牛乳配方乳粉（（110.75±2.52）μg/mL、（47.91±1.36）μg/mL）（P＜0.05）。此外，山羊乳配方乳粉的牛血清白蛋白、IgG及乳铁蛋白水平均低于牛乳配方乳粉。在山羊乳配方乳粉中，仅酪蛋白水平高于牛乳配方乳粉，且无显著性差异（P＞0.05）。

图1 牛乳和山羊乳配方乳粉中6种主要过敏原质量浓度比较Fig. 1 Comparison of contents of six major allergens in bovine and goat milk formula powder

2.3 两种配方乳粉体外模拟胃液消化后的稳定性比较

食物蛋白经胃蛋白酶消化后的稳定性是影响其被肠道免疫系统识别并提呈给T细胞的关键因素，理论上过敏原在经过小肠吸收进入免疫系统前需耐受消化降解，保持足够完整又有免疫原性的蛋白或蛋白片段才具有潜在致敏性。一些重要的食物过敏原（如大豆中的β-伴大豆球蛋白）在模拟胃液中能稳定60 min以上，而非过敏原（如马铃薯酸性磷酸酶）在15 s内就被完全消化[14]。对牛乳和山羊乳配方乳粉体外模拟胃液消化后进行SDS-PAGE，结果如图2所示，35～40 kDa附近的条带为酪蛋白的不同亚基，15～25 kDa附近的条带主要是β-乳球蛋白，其分子质量在18 kDa左右[15]。β-乳球蛋白和酪蛋白是乳中的主要过敏原[16]，其中，约82%的牛乳过敏患者对β-乳球蛋白过敏[17]。牛乳配方乳粉及消产物的可见蛋白片段，尤其是β-乳球蛋白于60 min仍不能被全部消化，表明牛乳配方乳粉中的蛋白质在模拟胃液中极难消化；山羊乳配方乳粉及消化产物的可见蛋白片段在15 s～2 min内全部消化，表明山羊乳配方乳粉中的蛋白在模拟胃液中易消化。

图2 牛乳和山羊乳配方乳粉模拟胃液消化后的SDS-PAGE图Fig. 2 Electrophoresis profiles of simulated gastric digests of bovine and goat milk formula powder

2.4 人体血清学分析两种配方乳粉的致敏性

食物蛋白与其特异性IgE的结合能力是食物过敏效应阶段激活肥大细胞的关键，过敏患者的血清与特异性IgE结合能力越低，则越不易发生过敏反应。参照农业部2406号公告-5-2016，利用牛乳过敏患者血清分析了牛乳配方乳粉、山羊乳配方乳粉与血清中其特异性IgE的结合能力。结果如图3所示，样品蛋白与过敏患者血清结合组OD值大于非过敏血清结合组OD值的2 倍，且存在显著性差异（P＜0.05），呈现阳性结果，表明两种乳粉均具有致敏性。此外，对于每名过敏患者来说，牛乳配方乳粉组的OD值大于山羊乳配方乳粉组，表明牛乳比山羊乳中过敏原与血清IgE的结合能力更强，表现出更高的致敏性。

图3 人体血清学分析两种配方乳粉的致敏性Fig. 3 Allergenicity of two formula milk powders with human serological study

2.5 BALB/c小鼠食物过敏模型分析比较两种配方乳粉致敏性

动物模型能够反映食物蛋白在体内引发过敏反应的实际情况，用于评价食物潜在致敏性。BALB/c小鼠具有显性遗传性过敏性疾病，是高IgE应答品系，适合作为食物致敏性评价的动物模型。本研究采用BALB/c小鼠食物过敏模型比较了牛乳配方乳粉和山羊乳配方乳粉诱发机体发生过敏的程度。实验期间各组小鼠体质量和食物利用率分别如图4A、B所示，各组间小鼠体质量与食物利用率均无显著性差异（P＞0.05）。

图4 小鼠的体质量变化及食物利用率情况Fig. 4 Changes in body mass and feed utilization of BALB/c mice

2.5.1 致敏小鼠体温变化及食物过敏症状评分

对BALB/c小鼠致敏处理后进行大剂量刺激，实验动物会产生体温下降的系统性过敏症状。本研究中，监测了刺激前至刺激后30 min内小鼠体温变化，体温下降幅度如图5A所示，阴性对照组与CT佐剂组之间无显著性差异；与阴性对照组（（－0.35±0.14）℃）和CT佐剂组（（－0.54±0.52）℃）相比，OVA阳性组（（－0.69±0.35）℃）、牛乳配方乳粉组（（－1.61±0.76）℃）和山羊乳配方乳粉组（（－0.92±0.68）℃）小鼠的体温均明显下降。其中牛乳配方乳粉组体温下降程度显著高于OVA阳性组和山羊乳配方乳粉组（P＜0.05）。实验动物致敏后大剂量刺激30 min内会出现强烈的过敏症状。本研究记录了刺激后30 min内小鼠临床过敏症状，并进行评分。如图5B所示，阴性对照组和CT佐剂组小鼠均未出现过敏症状，评分为0；OVA阳性组、牛乳配方乳粉组和山羊乳配方乳粉组小鼠均出现了不同程度的过敏症状，表现为毛发竖立、活动减少、呼吸困难、毛发较少处浮肿、嘴巴和尾巴苍白等临床过敏症状，其中牛乳配方乳粉组有一半小鼠过敏评分为3 分，山羊乳配方乳粉组1/3的小鼠过敏症状评分为3 分。山羊乳配方乳粉致敏小鼠从体温和临床症状中表现出更低评分的过敏症状。

图5 小鼠体温变化（A）及临床过敏症状（B）Fig. 5 Body temperature change (A) and clinical allergy symptoms in vivo (B)

2.5.2 小鼠血浆中组胺水平比较

经口大剂量刺激BALB/c小鼠能诱发血浆组胺水平的增加，这与食物过敏效应阶段的过敏症状相关。通过测定大剂量刺激后30 min血浆中组胺的水平可以反映小鼠过敏反应，结果如图6所示。与阴性对照组相比，OVA阳性组、牛乳配方乳粉组和山羊乳配方乳粉组小鼠血浆中组胺水平均显著增加（P＜0.05），而山羊乳配方乳粉组小鼠血浆组胺水平显著低于牛乳配方乳粉组（P＜0.05）。此外，CT佐剂组小鼠血浆中组胺水平与阴性对照组相比也显著增加，这可能与CT佐剂增强非特异性免疫作用有关。

图6 小鼠血浆组胺水平Fig. 6 Plasma histamine levels in vivo

2.5.3 小鼠血清中特异性抗体水平比较

过敏反应属于TH2型免疫反应，因此本研究测定了小鼠血浆中2种TH2型特异性抗体IgE和IgG1的水平，通过光密度表征比较两组特异性抗体的水平，结果如图7所示。与阴性对照组和CT佐剂组相比，OVA阳性组、牛乳配方乳粉组和山羊乳配方乳粉组小鼠血清中IgE和IgG1水平均显著增加（P＜0.05），而山羊乳配方乳粉组小鼠的2种抗体水平均显著低于牛乳配方乳粉组（P＜0.05）。

图7 小鼠血清特异性抗体水平Fig. 7 Serum specific antibody levels in vivo

2.5.4 两种配方乳粉对血管渗透性增加水平的影响

食物过敏会诱发血管渗透性的增加，在对BALB/c小鼠注射伊文思蓝并进行经口大剂量刺激后，如图8所示，OVA阳性组、牛乳配方乳粉组和山羊乳配方乳粉组的脚掌产生了蓝色，而阴性对照组、CT佐剂组未出现蓝色，其中牛乳配方乳粉组小鼠脚掌蓝色比山羊乳配方乳粉组更明显，说明其诱发的血管渗透性增加水平更高，过敏症状更严重。

图8 小鼠血管渗透性结果Fig. 8 Vascular permeability results in vivo

2.5.5组织病理学分析两种乳粉的致敏情况

为了研究受试蛋白在组织水平上产生的致敏效应，经口大剂量刺激BALB/c小鼠后取脾脏、肺、肝脏和空肠组织通过HE染色进行组织病理学检测。如图9A所示，阴性对照组和CT佐剂组小鼠脾脏、肺、肝脏和空肠组织形态结构正常，无明显炎症。OVA阳性组、牛乳配方乳粉组和山羊乳配方乳粉组小鼠脾红髓出现淋巴细胞聚集，肺组织局部有淋巴细胞浸润灶。其中山羊乳配方乳粉组小鼠肺组织局部仅有炎性细胞分布；牛乳配方乳粉组小鼠小肠绒毛肿胀、脱落。

此外，本研究还对各组织中的肥大细胞进行了甲苯胺蓝染色，直观地观察了各组肥大细胞脱颗粒水平。图9B甲苯胺蓝染色结果显示，OVA阳性组、牛乳配方乳粉组和山羊乳配方乳粉组中显示出多数肥大细胞胞膜破裂，轮廓不清，并已排出颗粒，而阴性对照组和CT佐剂组多数肥大细胞膜完整，轮廓清晰，大部分未脱颗粒。牛乳配方乳粉组脱颗粒肥大细胞的数量高于山羊乳配方乳粉组。

2.6 两种配方乳粉与牛乳过敏患者血清反应性比较

为了研究山羊乳配方乳粉是否会与牛乳过敏患者血清发生反应，本研究通过Western blotting测定比较山羊乳配方乳粉和牛乳配方乳粉与牛乳过敏患者血清的反应性。如图10所示，山羊乳配方乳粉能与牛乳过敏患者血清结合，但结合能力明显低于牛乳配方乳粉。

图10 山羊乳配方乳粉与牛乳过敏患者血清反应性结果Fig. 10 Cross-reactivity of goat milk formula powder with serum from cow’s milk allergy patients

3 讨 论

本研究利用动物实验和人体血清学实验对山羊乳配方乳粉的致敏性进行了研究，结果发现，与牛乳配方乳粉相比，山羊乳配方乳粉更易被胃液消化，与牛乳过敏患者的IgE结合能力更低，并且在BALB/c小鼠食物过敏模型中，山羊乳配方乳粉致敏的小鼠从临床症状、血液指标等方面表现出更低的致敏水平。山羊乳配方乳粉与牛乳过敏患者血清存在一定的交叉反应性，但其与过敏患者血清的结合能力明显低于牛乳配方乳粉。由于过敏患者血清中的抗体主要是针对某一特定过敏蛋白产生的，而牛乳和山羊乳中主要的过敏原蛋白的种类，尤其是β-乳球蛋白、α-乳球蛋白以及酪蛋白是一致的，两者只存在不同种类间含量上的细微差异，且山羊和牛的同源性高[18]，因此牛乳过敏患者血清与过敏蛋白的结合能力能够反映山羊乳的致敏性。加之牛乳过敏人群大多是2月龄～2岁以内的儿童，其主要食物为牛乳，临床上难以获得山羊乳过敏血清，后续研究可以采用山羊乳过敏患者血清进行进一步验证。Anggraini[19]、段翠翠[20]等通过ELISA及组织病理学等发现羊乳的致敏性低于牛乳，本研究也与其结果相符。

羊和牛均属于哺乳纲、偶蹄目、牛科，两者在亚科水平开始存在差异，两者在生物学上即存在较强的同源性。本实验研究结果也表明，从蛋白质组成的角度，山羊乳配方乳粉和牛乳配方乳粉中的主要蛋白质种类极其类似，差异主要存在于含量不同。牛羊乳具有高同源性，但羊乳的致敏性却显著低于牛乳，这可能是因为不同种类的蛋白在过敏中的作用及其致敏性不同。牛乳中主要过敏原有酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白[21]，其中，酪蛋白约占78.5%，αs1-酪蛋白是主要的致敏性蛋白[22]，有文献报道，大约有65%的牛乳过敏患者对酪蛋白过敏[23]；β-乳球蛋白在牛乳中以36 kDa的二聚体形式存在，许多动物源性过敏原，如马主要过敏原Equ C1、主要的鼠源性尿蛋白等都属于该类蛋白[24]；α-乳白蛋白具有调节乳糖合成的功能，并且具有较高的钙亲和力[25]，大约51%的牛乳过敏患者对该蛋白过敏[26]。而相比于牛乳，羊乳中的αs1-酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量均较低，β-酪蛋白和αs2-酪蛋白含量相对较高。有研究发现，牛乳和羊乳中的β-酪蛋白均会诱导高水平的TNF-α分泌，而αs2-酪蛋白会诱导IL-1β分泌[27-29]，两者均为TH1型细胞因子，由于牛乳过敏多是TH2型免疫反应，因此推测羊乳具有更低致敏性的原因一方面可能是由于调节TH2型反应向TH1方向偏移所致；另一方面能是由于抗原表面位点差异带来的致敏性的不同。有研究通过SOPMA、the BepiPred 1.0网络服务器和DNASTAR 3种生物信息学软件预测出了牛羊乳两者分别所含的αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白抗原表位肽段[30]，发现二者抗原表位存在少部分的重叠信息，并且在肠Caco-2细胞转运中的结果也有区别。此外，牛羊乳的酪蛋白抗原性受到胃肠消化液的影响，这有可能是因为变性导致天然结构破坏，内部隐藏的抗原表位暴露。圆二色谱和红外光谱检测结果表明，与牛乳β-酪蛋白相比，羊乳β-酪蛋白的二级结构中，α-螺旋、β-折叠和β-转角的含量更低，无规则卷曲含量更高，其分子结构更倾向于无序性，并且在pH 2～4和6～10 时，羊乳的β-酪蛋白溶解性高于牛乳β-酪蛋白，这也加强了羊乳中致敏蛋白的消化性，进而表现出更低的致敏性[31]，本研究中模拟胃液消化的结果也验证了这一点。

4 结 论

本研究通过蛋白质潜在致敏性树状评估策略，利用生物信息学、消化稳定性、人体血清学、动物模型对山羊乳配方乳粉的致敏性进行评价，利用牛乳过敏患者血清对山羊乳配方乳粉与血清中IgE之间存在的交叉反应性进行研究。结果发现，山羊乳配方乳粉更易消化，与过敏患者血清的结合能力更弱，并且在动物模型中表现出更低水平的过敏症状和指标变化，交叉反应性结果表明山羊乳配方乳粉能与牛乳过敏患者血清结合，但结合能力明显低于牛乳配方乳粉。综上所述，山羊乳配方乳粉与牛乳配方乳粉相比致敏性较弱，可作为一种潜在并有前景的牛乳过敏患者替代乳制品。本实验所采用的系统的致敏性评估方法，完善了目前山羊乳食物过敏研究的数据，并为其作为牛乳过敏患者的替代乳源提供了进一步科学数据。