M1型巨噬细胞参与炎症反应的生信分析*

张颖超，米 焱，王彩丽

(内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院，内蒙古 包头 014010)

巨噬细胞为单核吞噬细胞的一种，全身各组织器官广泛分布，不仅具有清除病原体、促进组织发育和伤口修复等功能，还是调控免疫、代谢、细胞凋亡的重要介质，因此在维持内环境稳态及炎症微环境等方面发挥重要作用[1]。其具有可塑变形性，可根据微环境的变化极化为功能不同的表型：M1型(典型激活的巨噬细胞)和M2型(交替激活的巨噬细胞)。M1型分泌促炎因子，促进炎症加重组织损伤，M2型可由循环中招募或由M1型转化而来，具有抑制炎症、修复组织细胞损伤的作用[2]。因此M1型巨噬细胞在炎症形成过程中十分关键。信号转导和转录激活蛋白1(Signal Transducer and Activator of Transcription, STAT1)调节巨噬细胞向M1型极化的中心转录因子，其活性是影响巨噬细胞向M1型极化的关键因素之一[3-4]。

微小RNA(MicroRNA，miRNA)是一类非编码小RNA，参与调节细胞生长和组织分化，在细胞增殖、分化、凋亡等过程发挥重要作用[5]。miRNA通过一些关系紧密的核心转录调节因子在巨噬细胞激活和分化过程中起调控作用，参与巨噬细胞极化过程[6]，在炎症性疾病的治疗方面具有十足潜力。生物信息学分析是目前预测分子机制和基因间关联性的有效研究方法，目前已广泛应用于各学科领域。本研究利用美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)平台下的基因表达综合数据库GEO中的人源单核巨噬细胞相关基因芯片数据进行分析处理，预测M1型巨噬细胞参与炎症的关键基因以及调控该基因的miRNA，为后续巨噬细胞极化在糖尿病肾病中的作用及相关信号通路的研究奠定理论基础。

1 资料与方法

1.1芯片数据资料 本研究中所选用的糖尿病肾病相关基因表达谱数据资料来自 NCBI 的 GEO数据库 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。检索策略：“macrophage and inflammation”(关键词)，“Homo sapiens”(研究对象)，“Expression profiling by array”(研究类型)。数据入选条件：数据集来自全基因组 RNA 表达芯片；实验使用人源单细胞诱导衍生的巨噬细胞。经过精细筛选，最终选取芯片数据GSE61298和 GSE36537。芯片信息分别为 Affymetrix Human Gene Expression Array和Agilent - 014850 Whole Human Genome Microarray 4x44K G4112F (Probe Name version)。本研究选择检测样本的平台分别为GPL15207和GPL6480，数据集共包含18例单细胞诱导衍生的巨噬细胞的基因表达阵列数据。

1.2数据处理 通过使用在线工具GEO2R(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo /geo2r/)下载数据及筛选差异表达基因(differential expressed genes, DEGs)。筛选标准为P.Val<0.05，log FC>0.5或Log FC<-0.5，并将探针名称转化为标准基因名称。

WebGestalt数据库(http://www.webgestalt.org)对所筛选的上调差异基因进行注释、可视化和综合探索。将已分析好的DEGs数据导入该数据库，通过其中的基因功能注释版块，根据基因标识对这些DEGs进行GO和Pathway注释，计算每个 GO term 和 Pathway term 的显著性水平(P-value)并根据P<0.05且富集基因数≥1来筛选DEGs富集的显著性 GO term 和 Pathway term；同时筛查关键基因主要参与的信号通路。

STRING 11.0数据库(http://www.string-db.org/)物种选择“Homo sapiens”后分别上传上调的DEGs，构建DEGs的蛋白质相互作用 (protein protein interaction, PPI)网络，并应用Cytoscape3.7.2软件进行可视化分析。采用Cyto Hubba插件通过网络拓扑特性构建蛋白质互作网络，并使用 Network analysis 插件计算节点度，选取节点度>10的DEGs 进行排序，最终圈定HUB基因。

miRWalk数据库(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)、miRcode数据库(http://www.mircode.org/mircode/)物种选择“Homo sapiens”后分别上传HUB基因，预测调控HUB基因的上游miRNA并做交集处理。

2 结果

2.1DEGs的筛选 共筛选出由单核细胞诱导极化为M1型的巨噬细胞有123个高表达基因，7个低表达基因。见表1。

表1 M1型巨噬细胞DEGs

2.2GO和KEGG富集分析 通过WebGestalt数据库对上述M1型巨噬细胞高表达的差异基因从分子功能、细胞组分、生物学过程三方面进行GO(图1)和KEGG(图2)功能富集分析。

图1 M1型巨噬细胞DEGs中上调基因的GO分析

图2 M1型巨噬细胞DEGs中上调基因的KEGG分析

分析显示，M1巨噬细胞上调的差异基因主要在刺激反应、生物调节、代谢过程、细胞通讯、多细胞生物的过程、多组织过程、局限化、发展过程、细胞成分组织、细胞增殖等生物过程富集；在细胞膜、细胞质、细胞核、内膜系统、囊泡、膜封闭腔、蛋白质包含复杂、细胞外间隙、高尔基体、细胞骨架、内质网等细胞组成富集；在蛋白结合、离子结合、核苷酸结合、水解酶活性、转移酶活性等分子功能富集。

分析显示，DGEs富集最显著的信号通路为：NOD样受体信号通路、金黄色葡萄球菌感染、RIG - I样信号通路、甲型流感、补体系统、麻疹、单纯疱疹病毒感染、JAK - STAT信号通路、EB病毒感染以及肝炎。

2.3DEGs的蛋白相互作用 利用STRING 11.0软件，对123个M1型巨噬细胞高表达差异基因进行PPI网络分析(图3)。使用cytoscape分析得到前20个最关键的枢纽基因(表2)。使用Cyto Hubba插件分析上述20个关键基因的蛋白质相互作用的关联度，依据其节点度的不同程度大小排序(图4)。

2.4预测调控HUB基因的miRNA 预测结果见表3、表4。对结果进行交集分析，最终得出miR - 23a靶向作用于STAT1。

图3 M1型巨噬细胞高表达的DEGs的蛋白质相互作用结果

表2 cytoscape分析前20个基因互作网络

图4 Cyto Hubba插件分析M1型巨噬细胞关键DEGs的PPI结果

表3 miRcode数据库预测调控STAT1的miRNA

表4 mirWalk数据库预测调控STAT1的miRNA

3 讨论

巨噬细胞属于单核吞噬系统的成员，对维持正常以及病变肾脏组织的稳态以及免疫反应意义深远，促进炎症形成。各种刺激信号可改变巨噬细胞内的转录因子网络进而对基因表达进行调控，从而使细胞表型发生变化[7]。巨噬细胞在不同的生理病理条件下极化为M1型和M2型，分别发挥不同的作用。生物信息学分析技术是通过特定的生物信息数据库检索某种疾病或基因分子，筛选符合要求的数据资源，进一步利用所需的在线分析软件，从各个方面剖析疾病的病理生理，基因代谢的相关机制，最终选取疾病分子发生机制的关键基因或生物标志物，挖掘靶基因的作用途径，寻找可能的信号通路以及靶点。本研究中，利用生物信息学方法对GSE61298和GSE36537两样本中M1型巨噬细胞高表达的DGEs深入分析，预测STAT1基因可能为巨噬细胞极化诱导炎症反应的HUB基因，且miR - 23a靶向调控STAT1调节M1型巨噬细胞介导的炎症反应。

STAT1为首个被发现的哺乳动物的STAT家族成员，是连接细胞膜受体与效应器间信号传导的重要蛋白[8]，可通过各种生物途径对巨噬细胞数量和表型进行不同程度的调节，在巨噬细胞极化过程中扮演重要角色。现今，对于调控STAT1的miRNA的研究逐渐深入。miR - 23a是众多miRNA中的一种，血浆循环miR - 23a的水平变化和糖耐量的受损息息相关，在2型糖尿病的发生发展中起关键作用，参与了2型糖尿病的炎症等调节[9]。在过表达miR - 23a 后，促炎因子TNF - α、IL - 12水平降低，说明在巨噬细胞中miR-23a参与调控炎性反应并且表现为明显的抑制作用[9]。但是在干预STAT1表达时，促炎因子TNF - α、IL - 12的含量在M1型巨噬细胞显著降低，抗炎因子IL - 10含量增加[10]，而miR - 23a能够抑制STAT1的表达[11]。miR - 23a靶向调控STAT1的具体信号通路尚未完全明确。本研究结果显示，上调的DEGs在NOD样受体信号通路、JAK-STAT信号通路等富集。研究发现在糖尿病肾病的进展过程中，JAK - STAT通路可被高血糖、血管紧张素Ⅱ、晚期糖基化终产物、活性氧、生长因子、细胞因子和其他上游信号激活[12]。在IgA肾病大鼠模型中，抑制miRNA - 21的表达可抑制p - JAK2及p - STAT3蛋白表达水平，从而抑制JAK2 / STAT3信号通路，减轻肾脏组织的炎症和纤维化[13]。因此，减少组织中巨噬细胞的M1表型以及寻找调控M1表型极化的关键基因和上游miRNA及相关作用通路对于糖尿病肾病等疾病的慢性炎症治疗具有重大意义。

巨噬细胞作为重要的炎症介质在机体内参与各种疾病的病理过程，具体作用机制及相关信号通路尚未完全明确，本研究通过对GEO数据库相关数据资源进行挖掘并进行生物信息学分析明确STAT1在M1型巨噬细胞中高表达，在巨噬细胞的极化中发挥重要作用，进一步通过miR数据库预测miR - 23a靶向作用于STAT1基因参与炎症反应，此结果作为后续实验的一个重要的切入点和验证点，具体的信号通路需要进一步实验论证。