稻瘟病菌无毒基因AVR-Pik一个新单倍型的功能鉴定

郭嘉媛 黄健强 吴亦灵 洪永河 陈晓峰

摘 要：稻瘟病菌无毒基因的变异会导致水稻抗病品种丧失抗性，因此，稻瘟病菌无毒基因变异机制的研究对于水稻抗病育种及抗病品种合理布局具有重要指导意义。为了更加全面地了解稻瘟病菌无毒基因AVR-Pik的变异机制，对课题组前期获得的来自全国各地100多株稻瘟病菌田间菌株中AVR-Pik位点的突变进行分析，发现了一个新单倍型AVR-PikG，其编码产物含有一个未见报道的点突变M58I。进一步的功能鉴定结果显示，表达Avr-PikG的稻瘟病菌菌株对所有供试Pik单基因系水稻均有毒，而表达Avr-PikDM58I的菌株则对所有供试Pik单基因系水稻无毒，表明目前所有已知Pik等位基因的编码产物均无法识别新单倍型Avr-PikG，而Avr-PikG所含点突变M58I可能与其成功逃避抗病蛋白识别无关。

关键词：稻瘟病菌;无毒基因AVR-Pik;新单倍型;毒性分析

中图分类号：S 435   文献标志码：A   文章编号：0253-2301（2022）03-0007-06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2022.03.002

Functional Identification of the Novel Haplotype of Avirulence GeneAVR-Pik in Magnaporthe oryzae

GUO Jia-yuan2， HUANG Jian-qiang2， WU Yi-ling2， HONG Yong-he2， CHEN Xiao-feng1*

（1. College of Geography and Oceanography， Minjiang University， Fuzhou， Fujian 350108， China;

2. College of Plant Protection， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China）

Abstract： The variation of avirulence genes （AVR genes） in Magnaporthe oryzae always leads to the breakdown of resistance in disease-resistant rice cultivars. Therefore， the study on the variation mechanism of AVR genes in M. oryzae is of great guiding significance for the breeding and rational utilization of disease-resistant rice cultivars. In order to better understand the variation mechanism of AVR-Pik in M. oryzae， the variation of AVR-Pik locus in more than 100 field isolates of M. oryzae collected from all over the country was analyzed in this study， and a novel haplotype AVR-PikG was identified whose encoding product contains a previously unreported point mutation M58I. Further functional identification results showed that the strains expressing only Avr-PikG were virulent to all tested monogenic lines carrying different Pik alleles， while the strains expressing only Avr-PikDM58I were all avirulent， which demonstrated that Avr-PikG could evade the recognition of all known resistance proteins encoded by different Pik alleles， but the point mutation M58I in Avr-PikG might not be associated with its successful immune evasion.

Key words： Magnaporthe oryzae; Avirulence gene AVR-Pik; Novel haplotype; Virulence analysis

由稻瘟病菌Magnaporthe oryzae引起的稻瘟病被稱为“水稻癌症”，严重威胁我国乃至全球的粮食生产安全。在田间，稻瘟病菌无毒基因在水稻抗病基因的选择压力下极易发生突变，而这往往会导致新推广的水稻抗病品种在短短几年间就丧失抗性[1]。换言之，稻瘟病菌无毒基因决定着水稻抗病的持久性，因此，为了实现稻瘟病的可持续防控，系统、全面地研究稻瘟病菌无毒基因的变异机制和规律就尤为必要，相关研究也将有益于改进水稻抗病育种策略及现有抗病品种的合理布局。

AVR-Pik和Pik是稻瘟病病害系统中一对具有重要研究意义的无毒基因/抗病基因组合。水稻抗病基因Pik有多个等位基因位点，如Pik、Pikm、Pikp、Pikh、Piks、Pi1、Pi7等

[2-8]，在水稻抗病育种中具有重要应用价值且被广泛应用。而在与水稻长期的互作过程中，稻瘟病菌无毒基因位点AVR-Pik在经受来自不同Pik等位基因极强正向选择压力的情况下，会通过不断形成新的单倍型来逃避抗病基因的免疫识别。截至目前，科研人员共鉴定出10个AVR-Pik单倍型，分别为AVR-PikA、AVR-PikB、AVR-PikC、AVR-PikD、AVR-PikE[9]、AVR-PikF[8]以及H06、H07、H08和H09[10]，它们的主要区别在于第46、47、48、67和78位氨基酸的不同点突变方式。不同AVR-Pik单倍型对不同Pik等位基因具有识别的差异性和特异性，具体表现在对不同单基因系抗病品种的毒性上，例如含有AVR-PikD的菌株对Pik、Pikm、Pikp、Pikh和Piks等单基因系水稻均无毒，而含有AVR-PikF的菌株则对这些单基因系水稻都表现出毒性[8]。可见，上述5个氨基酸位点的多态性决定着与Pik等位基因产物的互作亲和力，而这正是在自然选择压力下AVR-Pik和Pik之间共进化的具体表现形式[11-12]。

为了揭示稻瘟病菌群体遗传多样性特点及其产生机制，本课题组前期对来自我国各地百余株稻瘟病菌田间菌株进行了基因组测序[13]，本研究在此基础上对各菌株中无毒基因AVR-Pik位点的突变机制进行了系统分析，并着重对鉴定出的一个新单倍型AVR-PikG进行功能鉴定，研究结果将进一步拓展对稻瘟病菌无毒基因AVR-Pik变异机制的认知，也将为有针对性地进行水稻抗病育种和抗病品种合理布局提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 稻瘟病菌菌株及单基因系水稻品种

稻瘟病菌菌株R88002不含任何AVR-Pik位点，是本研究中遗传转化的背景菌株;菌株FJ81278采自福建省，为AVR-PikD的供体;菌株YN08182c收集自云南省，为新单倍型AVR-PikG的供体。用于Avr-Pik位点分析的百余株稻瘟病菌田间菌株为课题组前期收集自黑龙江、北京、江苏、四川、湖北、浙江、江西、湖南、福建、云南、广东等地[13]。

水稻单基因系品种Pik、Pikm、Pikp、Pikh、Piks、Pi1、Pi7为本研究中对稻瘟病菌菌株进行毒性分析时所使用的供试材料，水稻品种丽江新团黑谷（LTH）为感病对照材料。

1.2 新单倍型AVR-PikG的序列分析

以稻瘟病菌菌株YN08182c侵染阶段的总cDNA为模板、使用引物AVR-Pik-OF/OR（引物序列见表1）扩增获得AVR-PikG的全长CDS片段，测序获得其序列后，使用Clustal X软件将所得序列的编码序列与已知10个Avr-Pik单倍型序列进行多重比对分析，再用MEGA X软件中的最大似然法（Maximum Likelihood method）构建系统发育树（bootstrap参数设置为1000）[14]。

1.3 表达Avr-PikG及Avr-PikDM58I的稻瘟病菌菌株构建

分别以稻瘟病菌菌株YN08182c与FJ81278的基因组DNA为模板、使用引物AVR-Pik-CF/CR扩增获得AVR-PikG与AVR-PikD的基因全长片段，并亚克隆进pKNTG载体获得重组质粒pKNTG-AvrPikG与pKNTG-AvrPikD。以菌株FJ81278的基因组DNA为模板、使用引物AVR-Pik-CF/AVR-PikDM-R及AVR-PikDM-F/AVR-Pik-CR扩增出含部分重叠区域且编码Avr-PikDM58I的两个片段，通过重叠延伸PCR技术将两个片段融合之后亚克隆进pKNTG载体获得重组质粒pKNTG-AvrPikDM58I。上述3个重组质粒经测序鉴定无误后，借助稻瘟病菌原生质体遗传转化的方法[15-16]分别导入菌株R88002，获得分别表达Avr-PikG、Avr-PikD及Avr-PikDM58I的菌株。

1.4 表达Avr-PikG及Avr-PikDM58I菌株的毒性分析

待供试单基因系水稻幼苗长至3叶1心期时，制备供试菌株的分生孢子悬浮液并调至浓度为1.0×105 个·mL-1，采用喷雾接种法进行接种。接种后的水稻幼苗先置于23～25℃的保湿筒内避光培养24 h后，转移至24～26℃且高湿的温室中促进发病，7 d后参考国际水稻叶瘟分级标准[17]调查并记录供试菌株对不同供试单基因系水稻的毒性。

2 结果与分析

2.1 新单倍型AVR-PikG的获得及其序列分析

为了系统、全面了解稻瘟病菌无毒基因AVR-Pik的变异机制，本研究对前期获得的100多株来自全国各地的稻瘟病菌田间菌株的全基因组序列中Avr-Pik位点进行了分析。结果显示，有16株菌株具有完整的ORF区，有12株菌株ORF区完全缺失，有13株菌株的ORF区存在大片段缺失或完全缺失（其中3株启动子区域同时存在大片段缺失，1株启动子区域插入一个POT3转座子，其余9株启动子区域插入有未知重复序列）;有1株菌株在ORF区缺失两个碱基、造成移码突变，且还含有2个有义点突变和1个无义点突变;有1株菌株在ORF区多了两个碱基、造成移码突变，且还含有3个有义点突变;此外，仅含有3个有义点突变的菌株共有40株，仅含有2个有义点突变的菌株有30株，仅含有1个有义点突变的菌株有4株。鉴定出的点突变位点有H46N、P47A/R、G48D、A67D、M78I/K以及M58I，其中H46、P47、G48、A67及M78为已报道的突变位点[8-9]，而M58尚未见报道。因此，将来自云南的菌株YN08182c中含有M58I点突变的Avr-Pik位点命名为Avr-PikG，其与已知Avr-Pik单倍型的序列比对结果如图1A所示，与Avr-PikD相比，Avr-PikG共含有5个有义突变位点，分别是H46N、P47A、G48D、M58I、M78K;Avr-PikG与最新发现的Avr-PikF的序列最为相似，仅相差一个有义突变位点，即M58I。进化分析结果如圖1B所示，Avr-PikG与Avr-PikF的亲缘关系最为接近，它们与其余单倍型一样都是由Avr-PikD进化而来。

2.2 表达Avr-PikG菌株的毒性分析

为了明确目前所有已知Pik等位基因编码的抗病蛋白能否识别Avr-PikG，本研究对只表达Avr-PikG的菌株R88002-AvrPikG在含不同Pik等位基因的单基因系水稻上的毒性进行了分析，结果如图2所示，所有供试菌株对感病对照水稻品种LTH均表现有毒，表明所有供试菌株都已成功接种;背景菌株R88002对所有供试单基因系水稻均有毒，只表达Avr-PikD的对照菌株R88002-AvrPikD对除Piks以外的所有供试单基因系水稻均无毒，而只表达Avr-PikG的2个供试菌株R88002-AvrPikG-3与R88002-AvrPikG-6则与背景菌株R88002一样，对所有供试单基因系水稻均有毒。这一结果表明，新单倍型Avr-PikG无法被目前所有已知Pik等位基因编码的抗病蛋白所识别。

2.3 表达Avr-PikDM58I菌株的毒性分析

为了明确M58位点是否与Avr-PikD正常的生物学功能有关，本研究对只含M58I点突变的Avr-PikD菌株R88002-AvrPikDM58I在含不同Pik等位基因的单基因系水稻上的毒性进行了分析，结果如图3所示，所有供试菌株对感病对照LTH均有毒，表明所有供试菌株接种成功;只表达Avr-PikDM58I的两个供试菌株R88002-AvrPikDM58I-3、R88002-AvrPikDM58I-11与只表达Avr-PikD的对照菌株R88002-AvrPikD一样，对除Piks以外的所有供试单基因系水稻均无毒，而背景菌株R88002对所有供试单基因系水稻均有毒。从毒性鉴定结果来看，Avr-PikD中第58位甲硫氨酸的单一突变并不会影响其原有的、对不同Pik单基因系水稻的毒性。

3 讨论与结论

稻瘟病是世界范围内水稻生产上最具毁灭性的病害之一，其病原的田间群体复杂多样，因无毒基因突变而引起的毒性变异迅速，使得该病害防治十分棘手。因此，对稻瘟病菌田间群体开展系统、全面的无毒基因变异机制研究十分重要，是制定持久有效的稻瘟病生态防控策略的理论基础。本研究通过分析100多株收集自全国各地的稻瘟病菌田间菌株中无毒基因AVR-Pik位点的序列变异，发现了一个新单倍型AVR-PikG，其编码产物除了含有已知的H46N、P47A、G48D、M78K等突变位点外，还含有一个未见研究报道的点突变M58I。

在成对被克隆的稻瘟病菌无毒基因和水稻抗病基因组合中，AVR-Pik和Pik是研究稻瘟病菌与水稻共进化分子机制的首选对象。已有研究发现，无毒基因单倍型AVR-PikD是进化上最原始的，其余单倍型都由它进化而来，进化的动力来源于相应抗病基因Pik的选择压力，具体表现在决定着与不同Pik等位基因产物互作亲和力的五个关键位点，即H46、P47、G48、A67、M78[11-12]。Pik-1和Pik-2是两个遗传连锁的水稻NLR（nucleotide-binding leucine-rich repeat）受体基因，它们编码的蛋白功能相对独立却共同决定着Pik水稻的抗病性[3-5]，其中Pik-1能与Avr-Pik直接互作，Pik-2雖不与Avr-Pik直接互作，却能与Pik-1互作，这样一来抗病反应信号通过Pik-1从Avr-Pik传递给Pik-2，进而激活特异的ETI抗病反应[7，18-20]。与典型的NLR蛋白一样，Pik-1含有保守的卷曲螺旋结构域（coiled-coil domain，CC）、重金属结合结构域（heavy metal-associated domain，HMA）、NBS-ARC（nucleotide-binding adaptor shared by Apaf-1， R-protein and CED4）结构域以及富含亮氨酸结构域（leucine-rich repeat domain，LRR），其显示出较高的序列多态性，且许多多态性位点聚集在与Avr-Pik发生互作的HMA结构域;而Pik-2只含有CC结构域、NBS-ARC结构域以及LRR结构域，其序列多态性水平较低

[18-19]。此外，科研人员通过对Pikp-1、Pikm-1与不同Avr-Pik单倍型的互作晶体结构进行解析明确了Pikp、Pikm的HMA结构域和Avr-PikD的互作主要发生在3个界面上，而Avr-PikD在这3个互作界面中的任何一个氨基酸位点的变化都会影响其与Pikp-1、Pikm-1之间的相互作用[19]。

本研究通过一系列毒性分析试验证实，目前所有已知Pik等位基因，即Pik、Pikm、Pikp、Pikh、Piks、Pi1、Pi7的编码产物均无法识别新单倍型Avr-PikG，但第58位甲硫氨酸的突变并不会影响Avr-PikD原有的、对不同Pik等位基因产物的互作亲和力。因此推断，在Avr-PikG所含点突变中，H46N、P47A、G48D及M78K与其毒性功能密切相关，而第58位甲硫氨酸并不位于已知的、与Pik-1的互作界面上，因此，单一的M58I点突变可能不足以改变其与相应抗病蛋白的互作亲和力。至于M58I点突变的生物学意义仍有待进一步研究揭示。

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（責任编辑：柯文辉）