杉木林转为油茶林对土壤细菌群落结构的影响

周红敏，彭 辉，陈杏林，王宏翔，张弓乔

（1.龙泉市林业科学研究院，浙江 龙泉 323700；2.凤阳山管理处，浙江 龙泉 323700；3.广西大学 林学院，广西 南宁 530000；4.中国林业科学研究院 林业研究所，国家林业局林木培育重点实验室，北京 100091）

土壤微生物作为土壤的重要组分之一，其多样性高且最为活跃，对土壤生态系统养分循环起着重要作用[1-3]。细菌作为土壤微生物数量最多的群体，其群落组成和多样性特征对土壤养分的形成和土壤的结构功能等具有较大的影响[4-6]。相关研究表明，不同的土地使用形式、管理措施[7-8]和植被类别[9-10]的变化都可以使土壤细菌结构特征发生变化。植被的变化对生态环境因子存在直接或间接的影响[11-13]，从而改变土壤细菌的分布和组成[14-16]。

杉木Cunninghamia lanceolata是我国南方重要的用材树种[17]。已有大量研究表明杉木连栽会造成土壤地力下降。如吴则焰等[18]研究发现杉木连栽会造成碳循环和氮循环菌的减少，病原菌增加。严绍裕[19]研究发现随着种植代数的增加土壤养分减少，林地生产力降低。油茶Camellia oleifera是世界四大木本油料树种之一，是我国特有的食用木本油料作物[20-22]。随着2008年以来国家和浙江省木本油料产业发展政策的出台及实施，油茶产业蓬勃发展，成为浙南山区经济发展特色产业。现已有大面积的杉木林改为油茶林，改变了土地的利用方式。目前对油茶林土壤已经进行了较多的研究，主要集中在不同水肥管理措施对土壤养分的影响[23-25]、不同林龄油茶对土壤养分[26]、酶活性变化[27-28]、油茶籽[29-30]和油茶炭疽病[31-32]等方面研究。但对于杉木林改为油茶林后土壤微生物群落的变化及其与土壤理化性质的关系变化仍不清楚，因此，本研究以杉木林和油茶林为研究对象，采用Illumina Miseq 测序技术，对杉木林改为油茶林后的土壤养分及微生物变化规律进行研究，以期为油茶林的可持续经营提供科学依据。

1 研究区概况

试验研究地位于浙江省龙泉市上圩林区（119°3′32″～19°4′17″E，27°59′5″～27°59′15″N），属于中亚热带季风气候，年均降水量为1 646.9 mm，年平均相对湿度79%，年均无霜期为261.2 d；年均气温为17.7℃，极端最高气温为41.5℃，极端最低气温为-8.5℃。杉木为南方主要造林树种，油茶是在杉木采伐迹地上造林，林龄10 a。油茶每年刀抚2 次，杉木林于2019年进行一次深挖除草。

2 研究方法

2.1 土壤样品采集

2020年10月在立地条件相近的杉木和油茶林中各选择3 块标准样地（20 m×20 m），每个样地均按照5 点取样法进行取样，去除表层的枯枝落叶，用取土器取0～20 cm 处的土壤样品，每一样地的5 个土样等量混合后去除石砾等杂质。采用4 分法将土样分为2 份，一份装入无菌自封袋中于冷藏箱带回，置于-80℃冰箱中保存，用于土壤细菌群落结构多样性测定；另一份风干后过筛用于土壤理化性质分析。

2.2 土壤理化性质测定

土壤理化性质测定参照鲁如坤[33]的土壤分析方法进行。环刀法测定土壤含水量；NaOH 熔融-钼锑抗比色法（岛津-UV2450）测定全磷；NaOH 熔融-火焰光度法（上分-FP6410）测定全钾；浓H2SO4-催化-流动分析仪（AA3）测定全氮；K2Cr2O7外加热法测定有机质；碱解-扩散法测定碱解氮；NaHCO₃浸提-钼锑抗比色法（岛津-UV2450）测定有效磷；CH3COONH4浸提-火焰光度法（上分-FP6410）测定速效钾；电位法（土∶水为1∶2.5）测定pH 值。

2.3 土壤DNA 提取和高通量测序

用E.Z.N.A.® Soil DNA Kit 试剂盒（Omega Bio-Tek）对土壤总DNA 进行抽提，NanoDrop2000检测DNA 的纯度和浓度；1% 琼脂凝胶对抽提的DNA 进行电泳检测。采用引物515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′） 和907R（5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′）对细菌16SrDNA的V4-V5 区进行扩增，PCR 扩增的反应条件包括：5×FastPfu 缓冲液和FastPfu 缓冲液各4 µL，2.5 mM dNTPs 2 µL，上下游引物各0.8 µL，DNA模 板10 ng。ddH2O 20 µL。PCR 扩增条件为：95℃ 3 min 预变性，6 个循环（95℃ 30 s 变性，55℃ 30 s，72℃ 45 s），最后72℃延伸10 min。PCR 产物用2% 琼脂糖凝胶电泳鉴定，使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit 纯化PCR 产物，通过Illumina公司的Miseq PE300平台进行测序（上海美吉生物医药科技有限公司）。

2.4 数据分析

所得数据用FLASH[34]软件进行拼接，fastp（0.19.6）软件[35]进行数据质控，用Uparse（7.0.1090）软件[36-37]对97%相似度水平有效系列进行OTU聚类分析。Alpha 多样性采用Mothur（1.30.2）软件进行分析。细菌各分类学水平丰度采用Qiime进行分析。根据OTUs 丰度信息，利用对样品进行多样性分析，包括Simpson 指数、ACE 指数、Coverage 指数、Chao1 指数、Shannon 指数。其中Coverage 数值越高则样本中序列被测出的概率越高。在门分类水平上统计细菌群落的组成，利用冗余分析(redundancy analysis，RDA) 对土壤理化性质和细菌群落之间关系进行评估。采用SPSS19.0 软件进行单因素分析和LSD 法显著性检验，Excel 2010 软件进行数据统计和作图。

3 结果与分析

3.1 土壤理化性质

由表1可知，油茶林中有效磷和速效钾含量显著高于杉木林，油茶林中有效磷和速效钾含量分别是杉木林的1.88、1.34 倍。油茶林土壤中全钾含量高于杉木林，但差异不显著（P＞0.05）。杉木林含水率、全氮、全磷、碱解氮和有机质含量显著高于油茶林（P＜0.05）。

表1 2 种植被类型土壤理化性质†Table 1 The soil physicochemical properties of the 2 plantations

3.2 土壤细菌群落多样性

6 个土壤样品中有效序列为433 757 条，序列平均长度为376 bp。杉木林的Shannon 指数显著小于油茶林（P＜0.05），说明油茶林土壤中细菌多样性较高（表2）。Simpson 指数大小反映的是物种分布的均匀程度，Simpson 指数越小，分布越均匀，杉木林的Simpson 指数（0.011 3）显著高于油茶林（0.006 1），细菌群落在油茶土壤中的分布比杉木林更均匀。Ace 指数和Chao1 指数值越大，说明物种数量较多且丰富度大，杉木林的Ace 指数（1 795.73）和Chao1指数（1 763.43）显著（P＜0.05）低于油茶林的Ace 指数（2 020.14）和Chao1 指数（2 096.16），油茶林中细菌数量和丰富度均显著高于杉木林。杉木林和油茶林的Coverage 指数均在99.2%以上，测序结果较为全面地反映细菌群落在样本中的真实状况。

3.3 细菌群落结构特征

6个取样点土壤样品中OTU 2 845个，门30个，纲88 个，目195 个，科295 个，属887 个。杉木林和油茶林土壤中检测出的细菌门分别为26 个和30 个。门水平下细菌的相对丰度见图1。杉木林土壤中相对丰度在1%以上的细菌门有7 个，油茶林土壤中相对丰度在1%以上的细菌门有8 个，杉木林和油茶林土壤中相对丰度均在1%以上的细菌门有6 个，排序为变形菌门Proteobacteria＞酸杆菌门Acidobacteria＞绿弯菌门Chloroflexi＞放线菌门Actinobacteria＞浮霉菌门Planctomycetes＞Myxococcota。在2 种林分类型中相对丰度均在10%以上的主要优势菌门为变形菌门、酸杆菌门和绿弯菌门。变形菌门的相对丰度在2 个植被类型中均最大，其中杉木林的变形菌门（35.2%）显著高于油茶林；酸杆菌门在2 个植被类型中相对丰度次之，第3 为绿弯菌门。杉木林中绿弯菌门和Myxococcota 显著低于油茶林（P＜0.05）；酸杆菌门、放线菌门和浮霉菌门3 个优势菌门在杉木和油茶间不存在显著差异（P＞0.05）油茶林中有4 个特有的门分别为匿杆菌门（Latescibacteria）、Spirochaetota、达达菌门（Dadabacteria） 和MBNT15。

表2 2 种植被类型土壤细菌多样性指数Table 2 Diversity indices of the soil bacteria communities in the 2 plantations

图1 门水平下细菌的相对丰度Fig.1 Relative abundance of bacteria at the phylum level

图2为纲水平下细菌的相对丰度。杉木林土壤中相对丰度大于1%的细菌纲有9 个，油茶林土壤中相对丰度大于1%的细菌纲有13 个。杉木林和油茶林2 个类型土壤中有9 个细菌纲均大于1%，分别为酸杆菌纲Acidobacteria、α-变形菌Alphaproteobacteria、纤线杆菌纲Ktedonobacteria、γ-变形菌Gammaproteobacteria、浮霉菌纲Planctomycetes、放线菌纲Actinobacteria、嗜热油菌纲Thermoleophilia、AD3、酸微菌纲Acidimicrobiia。杉木林中相对丰度在10%以上的主要优势菌纲为酸杆菌纲和α-变形菌，两个菌纲的相对丰度占总菌纲的一半以上。油茶林中相对丰度10%以上的主要优势菌纲为酸杆菌纲、α-变形菌、纤线杆菌纲和γ-变形菌。杉木林中α-变形菌和AD3 显著高于油茶林（P＜0.05)；油茶林嗜热油菌纲显著高于杉木林（P＜0.05)；酸杆菌纲、纤线杆菌纲、γ-变形菌、浮霉菌纲、放线菌纲和酸微菌纲在杉木和油茶间差异不显著（P＞0.05）。

图2 纲和属水平下细菌的相对丰度Fig.2 Relative abundance of bacteria at the class and genus level

图2为属水平下细菌的相对丰度，2 种植被土壤中已识别出的相对丰度在1%以上的细菌属有7 个，分别为：Acidibacter相对丰度3.02%～4.01%、热酸菌属cidothermus相对丰度1.41%～3.29%、短根瘤菌属Bradyrhizobium相对丰度2.03%～2.24%、Candidatus Solibacter相对丰度1.81%～2.15%、HSB_OF53-F07 相对丰度1.27%～1.87%、Conexibacter相对丰度1.32%～1.69%、Bryobacter相对丰度1.19%～1.81%。其他细菌属相对丰度为（83.72%～86.96%）。杉木林土壤中热酸菌属显著高于油茶林（P＜0.05），而Bryobacter显著低于油茶林（P＜0.05）。

3.4 环境因子对土壤细菌群落结构的影响

RDA 相关分析可知（图3），第一、二排序轴累计解释率分别为57.51%和32.9%，两者结合解释为90.41%，说明土壤环境因子对细菌群落结构影响较大。有效磷和碱解氮对第一排序轴贡献较大，碱解氮和含水率对第二排序轴贡献较大。

图3 土壤细菌与土壤理化性质的冗余分析Fig.3 Representative difference analysis（RDA）of the relationships between soil physicochemical properties and bacteria communities

表3直观反映出各优势细菌门及油茶林特有菌门与土壤环境因子的在2 种植被类型下的不同响应。绿弯菌门与全氮（r=-0.943**）极显著负相关（P＜0.01)，与含水率（r=-0.829*）、全磷（r=-0.886*）、碱解氮（r=-0.829*）和有机质（r=-0.886*）显著负相关（P＜0.05）。Myxococcota与含水率（r=-0.829*）和有机质（r=-0.886*）显著负相关（P＜0.05），与速效钾（r=0.886*）显著正相关（P＜0.05）。油茶林特有菌门与土壤环境因子的响应为：匿杆菌门与速效钾极显著正相关（P＜0.01)，与pH 值显著正相关（P＜0.05），与全氮、全磷和有机质极显著负相关（P＜0.01），与含水率、碱解氮显著负相关（P＜0.05）。Spirochaetota 与有效磷极显著正相关（P＜0.01），与碱解氮显著负相关（P＜0.05）。达达菌门与速效钾显著正相关（P＜0.05），与含水率极显著负相关（P＜0.01），与全氮、全磷和有机质显著负相关（P＜0.05）。

表3 土壤细菌优势门（门水平）、油茶林特有菌门相对丰度和土壤理化性质相关关系†Table 3 Correlation between soil physicochemical properties and dominant bacterial phyla,unique phyla of Camellia oleifera plantations

4 讨 论

通过Illumina Miseq 测序技术检测出杉木林和油茶林中共有OTU 2 845 个，门30 个，纲88 个，目195 个，科295 个，属887 个。杉木林和油茶林土壤中主要优势菌门为变形菌门、酸杆菌门、绿弯菌门。2 种植被类型中变形菌门和酸杆菌门的相对丰度之和均在52.8%以上，这跟2 种菌门的生态幅相对较宽有关，前人已有大量研究表明变形菌门和酸杆菌门是土壤中的优势菌群[38-39]。油茶林中有4 个特有的细菌门为匿杆菌门、Spirochaetota、达达菌门和MBNT15，说明植被类型的变化引起土壤细菌群落的变化。杉木林的变形菌门相对丰度显著高于油茶，与万盼等[10]研究结果相似，变形菌门属于异养型细菌[40]，在有机质含量高的土壤中相对丰度较高。杉木林有机质含量高于油茶林，可能与杉木于2019年进行一次深耕除草有关。酸杆菌门在2 种植被类型中相对丰度仅次于变形菌门，酸性土壤有利于酸杆菌门的生长，酸杆菌门在2 种植被类型间差异不显著。绿弯菌门是一类通过光合作用产生能量的细菌，在有机质含量低的土壤中更具竞争力[41]，绿弯菌门在有机质含量低的油茶林中更易生活。酸杆菌纲和α-变形菌是2 种植被类型的主要优势菌纲，说明虽然植被类型不同，但由于立地条件相似所以优势菌群有一定相似性。酸杆菌纲在2 种植被类型中的相对丰度均最大，跟已有研究酸杆菌门在土壤中相对丰度较高的结论一致[42]。酸杆菌纲的相对丰度杉木林高于油茶林，但差异不显著。在2 种植被类型的土壤中差异不显著。相关研究表明，土地植被类别的变化也会造成土壤理化性质的变化，从而进一步影响土地细菌结构群落的改变[43-45]。

细菌多样性是可以反映土壤生态系统的稳定性，细菌多样性越高，则越稳定[46]。油茶林土壤的Shannon 指数、Ace 指数和Chao1 指数均显著高于杉木林，说明栽植油茶后林地的细菌多样性和细菌丰度和数量均增加，林地土壤生态系统更加稳定。杉木林细菌群落分布较油茶林更为集中，可能是因为杉木的根系较油茶更发达，对土壤的影响作用更大。油茶林的细菌丰度和多样性均高于杉木林，与丁新景等[47]不同树种的植被类型影响细菌多样性的研究结果相似。绿弯菌门和Myxococcota 在杉木林和油茶林中存在显著差异。

土壤的理化性质对植物的微生物多样性和植物的生长有重要作用，是土壤肥力高低的重要指标[48]。绿弯菌门与全氮、含水率、全磷、碱解氮和有机质显著负相关。Myxococcota 与含水率和有机质显著负相关，与速效钾显著正相关。通过优势菌门和土壤理化因子的相关性分析可知，含水率、全氮、全磷、碱解氮、速效钾和有机质是影响土壤细菌群落的主要因子，与前人相关的研究基本一致[49]。2 种植被类型中未被鉴别出的细菌属相对丰度在80%以上，说明这2 种植被类型土壤中还有许多待深入研究的细菌微生物资源。

5 结 论

杉木和油茶的细菌群落覆盖度均在99.3%以上。杉木和油茶林的土壤的细菌丰度和多样性存在显著差异，油茶林的细菌多样性和丰度高于杉木林，杉木林的细菌物种分布较油茶林集中。杉木林和油茶林2 种植被类型主要优势菌门为变形菌门、酸杆菌门和绿弯菌门，丰度占细菌总量的69.5%～73.9%。主要优势菌纲为酸杆菌纲、α-变形菌。已鉴别出的优势菌属为Acidibacter、热酸菌属、短根瘤菌属。土地植被类型的变化引起土壤细菌群落结构的改变，土壤细菌优势门相对丰度和土壤化学性质相关分析表明，影响细菌群落结构的主要因子是含水率、全氮、全磷、碱解氮、速效钾和有机质。在今后的油茶林林地经营管理中，应加强有机肥的应用，使土壤肥力得到提升。本研究为杉木林转为油茶林后土壤理化性质及土壤微生物群落结构研究提供科学依据。虽然研究了细菌群落结构与土壤理化性质的相关性，但细菌群落结构除跟土壤理化性质有关外，还和根系分泌物和种植年限等因素有关，在后续的研究中还需进一步更深层次分析细菌群落结构多样性与环境因子的相关性。