不同方法诱导小鼠产生CD8+记忆性T细胞的研究

黄晓东 杨磊 黄清云 高雪辰

近年来记忆性T淋巴细胞在移植物免疫损伤中的作用已越来越受到人们的重视[1-2]，特别是同种移植中CD8+记忆性T细胞的作用尤受关注。有研究发现，CD8+记忆性T细胞能在极短的时间内清除再次进入到体内的抗原，发挥强大的免疫效能[3-4]。正是由于免疫反应以及免疫记忆的存在，使受体体内移植的健康器官难以长时间发挥功能甚至难以长期存活。自体移植在正常情况下，一般不会发生移植排斥反应，但是在同种异体间进行移植，常会发生不同程度的排斥反应，T细胞同样具有特异性和记忆性，在抑制排斥反应中起关键作用[5-6]。免疫学相关文献指出，不同品系小鼠之间进行皮肤移植和输注淋巴细胞的方法可以诱导机体产生免疫排斥反应[7-8]。本研究采用两种方法诱导小鼠机体产生免疫排斥反应，探讨并比较两种方法形成CD8+记忆性T细胞性质和数量的差异，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验动物 受体小鼠采用4～6周龄雌性Bal B/C小鼠，共100只，体重18～20 g；提供皮片和脾脏淋巴细胞的为同一只6周龄C57小鼠，体重25 g。所有小鼠均由广西医科大学动物实验中心提供。本研究动物实验设计方案已通过广西中医药大学第一附属医院伦理委员会批准。

1.2 仪器和试剂 冷冻离心机（德国Eppendorf公司，5810R）；流式细胞仪（美国 BD 公司，CannonⅡ）；流式荧光抗体 CD3-FITC、CD8-PE、CD44-FITC、CD62L-cy5.5（美国BD公司）；细胞培养箱（德国Thermo公司）；细胞培养相关试剂及耗材（中国四季青公司）；无菌手术器械，包括一次性方巾、眼科剪、眼科镊、持针器、一次性6-0带针缝合线（美国FST公司）；高压灭菌锅（德国Thermo公司）；1%戊巴比妥钠（中国点滴实验试剂有限公司）。

1.3 分组 将75只Bal B/C小鼠按随机数字表法分为移植组、1×106注射组、5×106注射组、1×107注射组、空白对照组，每组15只。

1.4 供体处理 将C57小鼠颈椎脱臼处死后浸泡于75%乙醇5 min，在生物安全柜内应用无菌操作取背部皮片，剪成每块约0.25 cm2，共15块，均浸泡于放有0.9%氯化钠溶液的平皿中并置于冰上，备用于移植组小鼠背部移植。然后将小鼠取右侧卧位，皮肤表面消毒后依次剪开皮肤、腹膜，无菌操作下取出整个脾脏，将脾脏置于有0.9%氯化钠溶液的平皿中，用2支1 ml注射器的针头（弯成直角）在脾脏表面刺破3～5个小孔后，再轻刮脾脏表面，充分将内部组织刮出置于平皿中形成细胞悬液。将细胞悬液用冷冻离心机以1 200 r/min离心5 min，弃上清液后加入红细胞裂解液，充分混匀后静置10 min。重复该步骤2次后，使用200目过滤网过滤掉杂质，所得细胞悬液即为淋巴细胞悬液。用牛鲍计数板计数后分别取出1×106个、5×106个、1×107个细胞各15份，重悬于0.2 ml PBS缓冲液中，制成相应的淋巴细胞悬液并置于冰上，备用于 1×106注射组、5×106注射组、1×107注射组小鼠腹腔注射。

1.5 受体处理 移植组小鼠采用1%戊巴比妥钠0.1 ml/10 g腹腔注射麻醉。剃除背部皮肤毛发后用75%乙醇消毒，并剪除约0.25 cm2，取供体皮肤在2、3、5、6、8、9、11、12 点钟方向进行缝合，然后置于台灯下复苏。1×106注射组、5×106注射组、1×107注射组小鼠分别注射制备好的淋巴细胞悬液0.2 ml。空白对照组小鼠腹腔注射PBS缓冲液0.2 ml。

1.6 CD8+记忆性T细胞百分比及CD3+T细胞数检测上述处理后1、2、3个月时，5组小鼠均按随机数字表法各取5只颈椎脱臼处死，取出脾脏制成淋巴细胞悬液，采用流式细胞仪检测CD8+记忆性T淋巴细胞百分比及CD3+T细胞数。CD8+记忆性T细胞用CD8-PE、CD44-FITC、CD62L-cy5.5进行标记。4℃避光染色30 min后用 300 μl PBS洗涤细胞，1 200 r/min离心5 min，弃上清液。重复该步骤2次，最终加入500 μl PBS重悬，上流式细胞仪检测CD8+记忆性T细胞百分比。CD3+T细胞数检测时采用CD3-FITC进行标记，细胞染色步骤同上，上流式细胞仪检测后可从软件中直接获得细胞CD3+T细胞数。

1.7 CD8+记忆性T细胞增殖能力检测 将剩余25只小鼠按照1.4、1.5中的方法重新制备5种小鼠模型，每组5只。在淋巴细胞产生最多的时间点（经预实验结果显示为2个月）处死各组小鼠，按1.4操作步骤将小鼠脾脏制成淋巴细胞悬液，进行CD8+记忆性T细胞分选、纯化。具体步骤按照CD8+记忆性T淋巴细胞隐性分选试剂盒说明书操作：分别将50 μl CD8&CD44&CD62L生物素抗体与各组小鼠淋巴细胞悬液混合，孵育15 min后加入试剂盒中所配磁珠，将细胞与磁珠充分混匀后孵育15 min，过磁力架15 min，弃磁珠，所得淋巴细胞悬液重复上述步骤1次，即得CD8+记忆性T淋巴细胞。CD8+记忆性T淋巴细胞的分选纯度使用流式细胞仪检测，染色及操作步骤同上；检测结果使用EXPO32流式软件进行分析，所分析细胞均为CD8+细胞。随后建立十字坐标系，横轴指标为CD62L，纵轴指标为CD44，目的细胞CD8+记忆性T细胞表达情况为CD44+CD62L-，即落在第二象限的细胞比例为CD8+记忆性T细胞比例。

经牛鲍计数板计数后，各组取相同数目的CD8+记忆性T淋巴细胞经羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（carboxy fluorescein diacetate succinimide ester，CFSE）染色，与经过辐照的C57小鼠脾脏细胞共培养，1周后采用流式细胞术检测CFSE染色阳性细胞荧光强度，并将结果使用Modify 3.0软件进行分析，比较5组小鼠CD8+记忆性T细胞的增殖指数，从而评价其增殖能力。

1.8 统计学处理 采用SPSS 16.0统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；组内不同时点的比较采用单因素重复测量方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 5组小鼠不同时点CD8+记忆性T细胞百分比及CD3+T细胞总数的变化和比较 5组小鼠处理后1个月时CD8+记忆性T细胞百分比和CD3+T细胞总数的差异均无统计学意义（均P＞0.05）。处理后2个月时，3个注射组小鼠CD8+记忆性T细胞百分比均高于移植组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），其中以1×106注射组百分比最高；移植组、1×106注射组、5×106注射组、1×107注射组CD3+T细胞总数比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），但与空白对照组比较均明显升高（P＜0.05）；处理后 3个月时，5×106注射组CD8+记忆性T细胞百分比高于移植组，差异有统计学意义（P＜0.05），而5组间CD3+T细胞总数比较，结果同2个月时。

1×106注射组小鼠在处理后2个月时CD8+记忆性T细胞比例最高，与处理后1、3个月比较差异均有统计学意义（P＜0.05）；5×106注射组、1×107注射组、移植组小鼠均在处理后3个月时CD8+记忆性T细胞比例最高，其中5×106组3个月时与1、2个月时比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。移植组、1×106注射组、5×106注射组、1×107注射组小鼠CD3+T细胞总数均在处理后2个月时最高，与1、3个月时比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。

表1 5组小鼠不同时点CD8+记忆性T细胞百分比及CD3+T细胞总数的变化和比较

2.2 5组小鼠CD8+记忆性T细胞增殖能力变化与比较 5组小鼠脾脏CD8+记忆性T细胞分选纯化后，纯度达到95.3%（图1），达到本研究所需要求。纯化后的CD8+记忆性T细胞与C57小鼠淋巴细胞共培养后，各注射组与移植组增殖指数的差异均无统计学意义（均P＞0.05）；各注射组、移植组与空白对照组比较，其增殖指数均有明显提高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表 2。

图1 CD8+记忆性T细胞分选、纯化后纯度检测

表2 5组小鼠CD8+记忆性T细胞增殖指数的比较

3 讨论

人体的免疫系统不仅具有实时免疫功能，同时也存在免疫记忆功能[9]，即在抗原初次对机体进行刺激时，促使一系列免疫细胞增殖、活化，进而发挥免疫功能[10]，如T淋巴细胞、B淋巴细胞以及浆细胞等，在抗原完全被清除后，会形成少量具有记忆功能的免疫细胞储存在机体免疫器官中，如CD8+T细胞，通常会在外界抗原入侵机体后1周左右达到高峰[11]。随后，在抗原被完全清除后，大部分效应性CD8+T细胞凋亡，并被脾脏所破坏，少部分则逐渐分化成为能够长期存活的记忆性T细胞[12]。记忆性T细胞无论是在器官移植排斥和抗肿瘤过程中，均发挥着至关重要的作用，同时也是移植免疫和肿瘤免疫领域的研究热点。近年来，关于记忆性T细胞的研究越来越多。由于机体在正常状态下细胞免疫未受到激活，记忆性T细胞在机体内含量十分低。因此，如何获取足够的记忆性T细胞，是进行记忆性T细胞研究的一个重要且困难的环节[13]。

本研究将传统的应用皮肤移植诱导CD8+记忆性T细胞的方法，与新的方法，即对小鼠进行同种异基因脾脏淋巴细胞注射诱导CD8+记忆性T细胞的方法进行了比较。结果发现，处理后2个月时最高CD8+记忆性T细胞比例可达到（42.28±2.74）%，高于传统的移植组；处理后3个月时，各注射组小鼠脾脏中CD8+记忆性T细胞百分比最高达到（56.57±1.28）%，而此时小鼠开始逐渐进入免疫记忆阶段，体内的CD3+T细胞总数开始下降，因此建议选取注射1×106个细胞，诱导时间为2个月，此时产生的CD8+记忆性T细胞百分比相对较高，CD3+T细胞总数较多，诱导周期相对较短，效果令人满意。同时，各注射组、移植组与空白对照组比较，CD8+记忆性T细胞增殖指数均有明显提高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

综上所述，记忆性T细胞通常以低水平存在于脾脏及外周血中，本研究所采用的方法有助于获取足够的记忆性T细胞，在进行记忆性T细胞的课题研究中具有一定的应用价值。