FCGBP 在头颈鳞状细胞癌中的表达和免疫功能分析

曹宇杰，沈志森，叶栋，陈佳意

有研究发现IgG-Fc 片段结合蛋白（FCGBP）在多种肿瘤发生、进展中起着重要作用，且与多种肿瘤的免疫细胞浸润相关。在结直肠癌中，特别是在转移性组织中，FCGBP 被发现高表达，并且FCGBP 的表达增加显著降低了结直肠癌患者的整体生存率[1]。而在胆囊癌中，FCGBP的表达相较于正常组织降低，并且是肿瘤生长因子1（TGF-1）诱导的上皮间充质转换的关键调节因子[2]。还有研究发现FCGBP在前列腺癌中低表达，且与疾病进展有关[3]。然而FCGBP 在头颈鳞状细胞癌（HNSC）中的作用和机制尚不清楚，本研究评估了FCGBP 在HNSC中的表达情况及其与预后的相关性，并初步探究FCGBP 与HNSC 免疫细胞浸润的关系。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 材料 从癌症基因组图谱（TCGA）数据库（https:/cancergenome.nih.gov//）下载基因转录组测序数据共544 例，其中499 例HNSC肿瘤组织数据，45 例正常组织数据。对每例肿瘤样本下载对应相关临床数据进行分析，包括年龄、性别、肿瘤分级、T 分期、N 分期和临床分期。人HNSC 标本15 例（在距肿瘤病灶边缘＞0.5 cm 处解剖）均来自在宁波大学附属李惠利医院住院并接受手术的患者，由病理医师盲检后确认为肿瘤或癌旁正常组织，并获得本院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 FCGBP表达水平、临床预后和通路富集分析 采用R 软件（3.5.1 版本）分析FCGBP 在499 例HNSC 肿瘤组织和45 例正常组织中的表达水平差异并作图，使用R 软件“survival”包进行Cox风险回归分析和生存曲线分析。使用“clusterProfiler”包的gseKEGG 函数进行基因集富集分析（GSEA）。

1.2.2 免疫组织化学染色与分析 采用甲醛固定手术切除的HNSC肿瘤及邻近组织，石蜡包埋后切成4 m 厚的切片，再用二甲苯和乙醇脱蜡。将切片在柠檬酸钠缓冲液（pH值6.0）中120℃煮沸20min，进行抗原修复，然后在3% H2O2中室温孵育10 min 以阻断内源性过氧化物酶。再将切片与FCGBP 兔单克隆抗体[Ab cam（Ab121202），Cambridge，UK]进行免疫反应，然后与二抗一同孵育。切片用二氨基联苯胺（Sigma，Cat No.ZLI-9018）溶液显色，苏木精复染，用各种浓度的酒精脱水后封片。在显微镜下观察FCGBP 免疫反应切片并由病理学医师解释。

1.2.3 免疫细胞浸润分析 采用由Newman 等[4]开发的CIBERSORT 软件计算基于基因表达数据的特定组织中的细胞组成，并评估目标细胞丰度。本研究利用R 软件对下载的HNSC 肿瘤组织数据进行筛选和矫正，然后使用CIBERSORT软件评估22 种免疫细胞浸润水平。利用R 软件统计FCGBP 表达量和免疫细胞浸润水平的相关性并绘图。

1.3 统计方法 采用R 软件及CIBERSORT 软件进行数据分析，计数资料采用2检验和Fisher 精确检验，并采用单因素及多因素Cox 回归分析。P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FCGBP 在HNSC 中的表达分析FCGBP 在HNSC 肿瘤组织中低表达（封四彩图1），FCGBP 低表达水平的HNSC患者OS 较差（P ＜0.001），预后不佳（封四彩图2）。进一步选择了3 种类型的HNSC肿瘤组织（舌癌5 例、喉癌5 例、下咽癌5例）和配对癌旁组织进行免疫组化实验，结果显示FCGBP在HNSC肿瘤组织中染色强度显著降低（封四彩图3）。

图1 正常组织和HNSC 肿瘤组织的FCGBP 表达水平

图2 不同FCGBP 表达水平的HNSC 生存率

图3 舌癌、喉癌、下咽癌肿瘤组织和癌旁正常组织的免疫组化染色结果（envision 二步法，×20）

图4 不同FCGBP 表达水平的HNSC 患者年龄、性别、病理分级、T 分期、N 分期、临床分期的分布情况

2.2 FCGBP 表达水平及其与HNSC 患者临床病理因素的相关性 FCGBP 的表达水平与HNSC 患者的T 分期及临床分期有关（封四彩图4）。相较于FCGBP 高水平表达组，在FCGBP 低水平表达组中，更高级别T 分期的HNSC患者比例明显增加（P=0.02），更高级别临床分期的HNSC患者比例也明显增加（P=0.009）（图1）。单因素Cox 回归分析显示，FCGBP 表达量、年龄及临床分期是影响预后的危险因素，见表1。多因素Cox 回归分析显示，FCGBP 表达量、年龄及临床分期是影响HNSC 患者预后的独立危险因素，见表2。

图1 FCGBP 表达水平与HNSC 患者T 分期和临床分期相关

表1 影响HNSC 患者生存的预后因素的单因素Cox 回归分析

表2 影响HNSC 患者生存的预后因素的多因素Cox 回归分析

2.3 FCGBP 在HNSC 中的GSEA 分析

在前10 条富集通路中发现有多条通路可能与免疫细胞相关，如细胞黏附分子、T细胞受体信号通路、B细胞受体信号通路、细胞因子及细胞因子受体相互作用通路。

2.4 FCGBP 与HNSC 中免疫细胞浸润相关性 与FCGBP 低表达组相比，在FCGBP 高表达组中，幼稚B 细胞、浆细胞、滤泡辅助性T 细胞（Tfh）、调节性T细胞（Tregs）、静息树突状细胞及静息肥大细胞浸润水平较高，而CD8+T 细胞、静息NK 细胞、M0 巨噬细胞、M2 巨噬细胞、嗜酸性粒细胞及中性粒细胞浸润水平较低。见图2。

图2 FCGBP 与HNSC 中免疫细胞浸润相关性

3 讨论

相较于正常组织，FCGBP 在HNSC肿瘤组织中低表达，并利用免疫组化实验证实了这一发现。据报道，在结肠癌中，与非转移性组织相比，FCGBP 在转移性组织中表达下调[5]。在骨肉瘤中，FCGBP 也被发现在肿瘤组织中表达下调。Wang 等[6]关于FCGBP 的泛癌研究发现，FCGBP在HNSC等7 种肿瘤组织中低表达，而在乳腺癌等14 种肿瘤中高表达，不同肿瘤类型中FCGBP的表达水平差异可能反映了不同的作用机制。本研究进一步发现 FCGBP 低表达与HNSC 患者的不良预后有关。临床病理因素分析表明，FCGBP 表达水平、年龄和临床分期与HNSC 患者预后相关，并且是独立的预后影响因子。这些结果提示FCGBP具有生物标志物的潜力，并可能作为HNSC 的保护因子。还有研究发现在HPV 感染的HNSC 患者中FCGBP表达水平上调，推测FCGBP 还与HPV感染有关，并且其上调与患者较长的生存时间相关[7]。GSEA 的KEGG 通路分析结果显示FCGBP 参与了多种免疫相关信号通路，这提示FCGBP可能在调节肿瘤免疫中起关键作用。

B细胞（也称B淋巴细胞）可生成抗体，充当抗原呈递细胞，并分泌细胞因子。Naive B 细胞可发育成为其他成熟B 细胞。浆细胞是终末分化的B 淋巴细胞，可构成性地分泌抗体，提供针对病原体的保护[8-9]。浆细胞可生成IgM、IgG 和IgE等高亲和力的抗体，提供免疫记忆[10]。Tfh 可以促进生发中心（GC）内B 细胞分化成浆细胞和记忆性B 细胞[11-13]。树突状细胞可以诱导T 细胞活化和分化，从而启动适应性反应，并且可以增强并调节免疫反应，增强外周T 细胞的耐受性[14-15]。肥大细胞经IgE 介导后活化，可能在抗肿瘤免疫中起重要作用[16]。本研究进一步评估了HNSC 肿瘤组织中22种免疫细胞的浸润水平，发现上述有利于免疫抑制作用的免疫细胞在高FCGBP表达组中浸润水平增加。M2 巨噬细胞主要参与降低炎症反应，与免疫抑制有关。一项前列腺癌的研究显示，相较于M2 巨噬细胞低表达组，高表达组患者生存率明显降低，且M2 巨噬细胞被认为是独立的危险因素[17]。M0 巨噬细胞又称非活性巨噬细胞，可以被细胞因子诱导从而向M1 或M2 表型转化。有研究发现M0 巨噬细胞浸润比例高的膀胱癌患者预后差[18]。在本研究中，M2、M0 巨噬细胞浸润水平在高FCGBP 表达组中显著降低，这提示FCGBP 可能降低了M0 巨噬细胞的表达水平，抑制M2 型巨噬细胞的转化。