松天牛小首螨对极端温度耐受性的驯化效应及低温存储研究

朱禹臻， 黄晨燕， 李俊楠， 付 煜， 吴松青， 张飞萍*

1福建农林大学林学院,福建 福州 350002; 2福建农林大学,生态公益林重大有害生物防控福建省高校重点实验室,福建 福州 350002

松材线虫Bursaphelenchusxylophilus(Steiner Buhrer) Nickle病是松树的毁灭性病害，已在我国造成巨大危害。松墨天牛MonochamusalternatusHope是松材线虫病的主要传播媒介，防治松墨天牛是遏制松材线虫病扩散蔓延的关键措施之一(宋红敏和徐汝梅，2006； 朱诚棋等，2017)。松天牛小首螨ParacarophenaxalternatusXu and Zhang是近年在福建闽侯首次发现的小首螨新种，也是首个能寄生并致死松墨天牛卵的天敌螨类，极具生物防治应用潜力(Xuetal.，2018)。然而，目前对该螨的研究甚少。

研究证明，通过特定时间、特定非致死温度条件下的饲养驯化，昆虫或螨类往往可以显著提高其对极端温度的耐受性，表现出显著的驯化效应(景晓红和康乐，2002； 李永涛等，2016； 岳雷等，2013)。明确天敌昆虫或螨类对极端温度耐受性的驯化效应，有助于深入了解其地理分布、使用区域、季节适应性，建立科学的应用方法。鉴于此，本研究测定了不同温度条件驯化下松天牛小首螨对极端温度的耐受性及其变化，以及不同低温条件下的生存时间，以期为利用该螨防治松墨天牛提供基础性依据。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

松天牛小首螨来源于实验室建立的实验种群，以松墨天牛卵为寄主进行繁育和保种，饲养条件为26 ℃、RH60%、12D∶12L。松墨天牛卵采于松树木段。

1.2 高温驯化试验

松天牛小首螨属于膨腹体胎生类，若螨在膨腹体中发育至成熟，仅见成螨阶段活动。该螨种群中雄螨的数量极少。本研究选择雌成螨为研究对象，将雌成螨进行高温驯化锻炼，再进行极端高温暴露处理。根据预试验结果，驯化高温设置30、33、37 ℃ 3个温度梯度，以25 ℃未经驯化处理为对照；驯化时间设置12、24、36、48、60 h 5个时间梯度；极端高温暴露条件为42 ℃3 h。温度由人工气候箱控制。

高温驯化处理后，将各组试螨随机进行高温暴露胁迫，然后直接放入25 ℃、RH60%的人工气候箱内饲养24 h，然后在体式显微镜下统计各处理的存活率。以螨体色泽鲜艳、体型饱满，用毛笔轻触第一对足有行为反应视为存活，以虫体无光泽、干瘪，毛笔触动无反应视为死亡。每处理均设5组重复，每组试螨30头，放置于2 mL透明离心管内并盖紧。

1.3 低温驯化试验

根据预试验结果，驯化低温设置10、15、20 ℃3个温度梯度，以25 ℃未经驯化处理为对照；驯化时间设置24、48、72、96、120 h 5个时间梯度；极端低温暴露条件为-10 ℃3 h。驯化温度由人工气候箱控制，胁迫低温条件由低温恒温槽控制。其余试验方法与1.2相同。

1.4 低温存储试验

1.4.1 低温存储对松天牛小首螨膨腹体涌出成螨数量的影响 以松天牛小首螨膨腹体作为存储对象。存储温度设置0、5、10 ℃3个处理，存储时间设置5、10、15、20、25、30 d 6个处理，温度由海尔牌调温冰箱控制。以寄生在松墨天牛卵上的松天牛小首螨膨腹体发育至第3天的天牛卵为测试对象，将5粒上述松墨天牛卵设为一组，放置于直径5 cm的玻璃培养皿中，皿壁涂凡士林以防涌出的成螨逃逸。将上述培养皿分别放置到不同温度的冰箱中存储，按照设定的存储时间处理完成后，取出培养皿并放入25 ℃、RH60%的人工气候箱中恢复和培养，连续观察6 d并记录膨腹体发育情况，统计涌出的成螨数量(该条件下松天牛小首螨膨腹体发育历期不长于4 d)。

1.4.2 低温存储对松天牛小首螨雌成螨存活的影响 以松天牛小首螨雌成螨为存储对象。存储温度设置4、10 ℃ 2个处理，用调温冰箱控制温度。存储时间设置5、10、15、20、25、30 d 6个处理。将30～40头从膨腹体涌出24 h内的松天牛小首螨雌成螨设为一个处理组，放入一个2 mL透明离心管中，管口塞入湿棉花保湿并盖紧，然后分别放入不同温度冰箱中存储。后按照设定的存储时间处理完成后，取出离心管放入25 ℃、RH60%的人工气候箱中恢复24 h，在体式显微镜下观察并记录雌成螨存活情况。对照组设置为25 ℃，由人工气候箱控制温度。每处理设3重复。

1.5 数据分析

用方差分析(ANOVE)比较驯化后极端温度暴露存活率，用LSD法比较平均数，用SPSS 23.0软件进行统计分析，用GraphPad Prism8软件制作图表。

2 结果与分析

2.1 高温驯化对松天牛小首螨极端高温耐受性的影响

方差分析结果表明，驯化温度和驯化时间均对松天牛小首螨雌成螨高温暴露存活率存在显著影响(驯化温度：F=15.627；df=2，30；P<0.05；驯化时间：F=19.116；df=4，30；P<0.05)，但驯化温度、驯化时间二者的交互作用未见显著影响(F=0.921；df=8，30；P>0.05)。由图1可知，与对照相比，经过驯化的雌成螨在高温暴露胁迫后的存活率均显著提高，其中30 ℃驯化36 h的存活率(50.57%)最高，是对照的2.26倍。

图1 不同驯化处理松天牛小首螨雌成螨极端高温暴露(42 ℃、3 h)下的存活率Fig.1 Survival rate of P. alternatus adult females exposed to 42 ℃ for 3 h after different acclimatisation treatments

2.2 低温驯化对松天牛小首螨极端低温耐受性的影响

方差分析结果表明，驯化温度、驯化时间以及两者的交互作用均对松天牛小首螨雌成螨极端低温暴露的存活率有显著影响(驯化温度：F=112.172；df=2，30；P<0.05；驯化时间：F=12.201；df=4，30；P<0.05；交互作用F=8.682；df=8，104；P<0.05)。由图2可知，与对照相比，各种驯化处理均显著提高了松天牛小首螨雌成螨在极端低温暴露下的存活率，其中10 ℃96 h、10 ℃120 h驯化处理的存活率(68.79%、69.98%)最高，是对照的3.08和3.13倍。

图2 不同驯化处理松天牛小首螨雌成螨极端低温暴露(-10 ℃、3 h)下的存活率Fig.2 Survival rate of adult P. alternatus females exposed to -10 ℃ for 3 h after different acclimating treatments

2.3 不同低温存储松天牛小首螨膨腹体涌出成螨的数量

不同低温条件存储下松天牛小首螨膨腹体涌出成螨的数量见表1。从表中可以看出，在特定存储时间下，3种存储温度之间的松天牛小首螨膨腹体涌出成螨数量总体上差异较小，尤其在15 d内，各存储温度处理下膨腹体涌出成螨的数量都比较多。然而，在特定存储温度下，随着存储时间的延长，膨腹体涌出成螨的数量逐渐显著减少。尤其是10 ℃存储20 d后、5 ℃存储25 d后、0 ℃存储30 d后膨腹体涌出成螨的数量大幅减少。

表1 不同低温存储松天牛小首螨膨腹体涌出成螨数量Table 1 The number of P. alternatus adults emerged from inflated abdomen stored at different temperatures

2.4 不同低温存储松天牛小首螨雌成螨的存活率

不同低温存储下松天牛小首螨雌成螨的生存曲线见图3。从图中可以看出，总体上随着存储时间的延长，该螨存活率逐渐下降，但不同存储温度之间存在明显差异。在对照25 ℃条件下，该螨在15 d内的存活率仅有50%左右，在30 d内死亡率超过80%；然而，在10 ℃条件下存储30 d该螨有65.10%的存活率，在4 ℃条件下存储15 d有92.11%的个体存活，存储30 d仍有84.21%个体存活。

3 讨论与结论

已有研究表明，我国松材线虫病有向北扩散的趋势(赵捷等，2017)。松天牛小首螨作为新发现控制该病主要媒介昆虫松墨天牛的潜在生防因子，研究该螨对极端温度的适应性具有重要意义。昆虫或螨类等变温动物经过特定温度驯化一定时间，能够显著提高自身对极端温度的耐受性，如：5 ℃短期低温驯化能够显著提高飞蝗LocustamigratoriaL.卵的耐寒性(王竑晟，2006)；低温驯化也能显著提高拟步甲科昆虫的耐寒性(库尔班·吐松等，2016)。秋季到冬季的温度季节性变化对大多数昆虫和螨类顺利越冬具有重要作用，能够减轻由于气温降低而引起的种群衰减(唐斌等，2004)。本研究表明，30、33、37 ℃驯化12～60 h，可显著提高松天牛小首螨雌成螨高温暴露胁迫后的存活率，尤其是30 ℃驯化36 h的存活率比对照提高了1.26倍。10、15、20 ℃驯化24～120 h可显著提高该螨极端低温暴露下的存活率，特别是10 ℃96 h、10 ℃120 h驯化处理的存活率均比对照提高了约2.1倍。上述结果说明，松天牛小首螨具有很强的温度适应性，短期的温度驯化即可大幅提升其对极端温度的耐受性；也说明尽管该螨目前仅在局部地区分布，但其潜在的分布或应用区域可能比目前发现的要广。

观察发现，松天牛小首螨世代周期短，4 d即能完成1代，繁殖力强，一个膨腹体可胎生上百只成螨。如何长期存储足够的螨虫，是实现该螨商品化运输和野外应用的重要问题。低温存储是天敌昆虫或螨类长期保存的一种常用方法，如：智利小植绥螨PhytoseiuluspersimilisAthias-Henriot在4 ℃下能够长期存储(刘佰明等，2012)；一些昆虫或螨类为适应不良环境常常产生休眠或滞育(华爱等，2002； 张曼丽和范青海，2007)。类似的环境条件也可以作为长期存储天敌昆虫或螨类的条件。本研究发现，在0、5、10 ℃低温下存储松天牛小首螨膨腹体，在15 d内各存储温度处理的膨腹体涌出成螨数量均较多；随着存储时间延长，膨腹体涌出成螨的数量逐渐显著减少，尤其是10 ℃存储20 d后、5 ℃存储25 d后、0 ℃存储30 d后，膨腹体涌出成螨的数量大幅减少；上述结果说明，0～10 ℃是存储松天牛小首螨的适宜温度，但膨腹体可能仅适合作为短期存储对象。以雌成螨作为存储对象时，在10 ℃下存储30 d仍有60%以上的存活率，在4 ℃下存储30 d有80%以上个体存活，说明雌成螨是适合中长期低温存储的对象，4 ℃是其中较优的一个存储温度选项。然而，有关雌成螨的适宜存储温度，仍需进一步研究弄清存贮温度对其活性、寄生率、寿命等的影响才能确定。