7种内共生病毒对柑橘木虱生殖力的影响

张岳乐， 李智强， 陈 倩

福建农林大学植物保护学院/媒介病毒研究中心/福建省植物病毒学重点实验室，福建 福州 350002

随着分子生物学和测序技术的发展，一些隐藏于昆虫体内但不引起宿主昆虫明显病症的微生物逐渐被熟知，这些微生物被称为共生微生物(Cowlingetal.,2013; Hong,2009)。共生微生物与昆虫的共生关系并不单单指互利共生，也包括对抗关系以及相互并无明显影响的共生关系。但在大多数情况下，共生关系不能严格地划分为仅属于这3类中的一类，它可以随环境或其他情况而变化。通常认为，共生微生物与宿主最多的是互惠互利关系(Hurst & Hutchence,2010)。近年来研究发现，某些共生菌与昆虫的生物学特性相关，如内共生菌不仅能合成昆虫宿主所需的营养成分，还可通过解毒昆虫宿主所摄取的植物次生物质，提高其对寄主植物的利用能力，以调节昆虫宿主的种群适应性(褚栋等,2006; 徐红星等,2009; Himleretal.,2011； Zabalouetal.,2004)。昆虫体内的细菌还与昆虫存在协同进化关系(Thao & Baumann,2004)。

柑橘木虱DiaphorinacitriKuwayama属半翅目Hemiptera木虱科Liviidae (Percyetal., 2018)，主要危害芸香科植物，以柑橘属受害最重，黄皮Clausenalansium(Lour.) Skeels、九里香Murrayapaniculata(L.) Jack.和枸椽CitrusmedicaL.次之，是传播黄龙病最主要的昆虫媒介，也是世界柑橘生产中最严重的害虫之一(叶志勇等,2006)。柑橘木虱的高龄若虫和成虫都能携带柑橘黄龙病的病原，一旦获毒就具有终生传病的能力(陈循渊, 1986)。随着宏基因组学的发展，越来越多的研究发现，除了能携带黄龙病病原菌之外，柑橘木虱体内还存在很多其他微生物，如内共生病毒(Nourietal.,2015； Sahaetal.,2012; Stackebrandt & Goodfellow,1991)。Nourietal.(2015)分析了世界范围内的柑橘木虱种群，发现柑橘木虱体内存在多种多样的类似于病毒的序列。Reeseetal.(2014)利用生物信息学，并采用桑格测序法(sanger sequencing)、RT-PCR和PCR验证，最终鉴定了很多新的病毒序列。随后，柑橘木虱呼肠孤病毒序列(Diaphorinacitrireovirus, DcRV)(Chenetal.，2019)、类小核糖核酸病毒(Picorna-like viruses, DcPLV)(Kooninetal.，2008)、类布尼亚病毒序列(Diaphorina citri Bunyavirus， DcBV)以及类浓核病毒序列(Densovirus-like sequences, DcDNV)(Nourietal.，2015)、柑橘木虱相关的C病毒(Diaphorina citri-associated C virus, DcACV)(Nourietal.，2016)、柑橘木虱类黄病毒(Diaphorina citri flavi-like virus, DcFLV)(Matsumuraetal.，2016)相继被发现。同时，Nourietal.(2015)在柑橘木虱体内也识别到了沃尔巴克噬菌体的序列(Wolbachia prophage WO) 。柑橘木虱体内还有合胞体共生菌(Syncytium endosymbiont)、里奥夸尔托病毒(Mal de Rio Cuarto virus, MRCV)、褐飞虱呼肠孤病毒(Nilaparvata lugens reovirus, NLRV)、噬菌体S-RSM4 (Synechococcus phage S-RSM4)和Al DNA(Tokyovirus Al DNA)(Hert,2008)。但这些共生微生物，特别是内共生病毒对柑橘木虱的影响尚不清楚。

新一代测序技术(next generation sequencing，NGS)具有快速、高灵敏度、高通量等特点，大大推动了病毒研究的进程。NGS可以在不知道病毒生物学、血清学特性和基因组信息的情况下快速检测未知病毒。通过大量的NGS数据分析，可以获得病毒基因组变异、准种重建、进化和宿主内起源(Ho & Tzanetakis,2014; Houetal.,2011)。高通量测序技术不仅能够检测到生物体内绝大部分含量低的病毒基因，而且不需要对病毒进行分离富集，避免了不可培养病毒信息的丢失。该技术的出现突破了传统病毒诊断技术对新病毒鉴定的局限性,创新了发现和鉴定未知病毒的方法，促进了病毒检测鉴定领域的发展(Nourietal.,2018)。高通量测序技术已在病毒种类多样性和发现新病毒等方面被广泛应用，对系统研究样本所携带病毒的多样性和遗传进化有重要意义(Liuetal.,2011; Nachappaetal.,2012)。

为探索柑橘木虱共生微生物的多样性，本研究利用转录组测序技术和小RNA深度测序技术，对福建省田间自然种群所携带的共生微生物进行分析鉴定，获得了若干个柑橘木虱共生微生物序列。根据序列的差异，区分出携带不同共生微生物的柑橘木虱种群。为了解释内共生病毒对柑橘木虱的影响，本研究进一步测定了柑橘木虱在不同共生微生物影响下的单雌总产卵量、单雌日产卵量、单雌寿命和单雌存活率，以揭示柑橘木虱内共生病毒对宿主昆虫种群的综合影响。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

柑橘木虱采自福建农林大学校园和福州市晋安区日溪柑橘园，于实验室人工气候箱内用九里香MurrayaexoticaL.分别培养，建立种群。培养条件为温度 25 ℃、光周期L∶D=16∶8、相对湿度60%～70 %。

1.2 总RNA提取与质检

从2个种群中分别选取20头柑橘木虱成虫，用液氮冷冻研磨后，用Trizol 法提取总RNA。分别用琼脂糖凝胶电泳和Nano Photometer spectrophotometer 检测RNA的纯度，检测合格后送至北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行转录组和siRNA文库构建和测序。

1.3 转录组拼接和功能基因注释

测序得到的原始数据去除序列接头、ploy-N 和低质量序列，获得高质量的clean data，同时计算Q20、Q30和GC含量。再利用Trinity 软件进行组装。使用BLAST 软件将组装得到的unigenes在七大数据库中进行比对，获得功能基因的注释信息。

1.4 含和不含7种内共生病毒的柑橘木虱种群的人工建立

由于2个种群的内共生微生物种类存在差异，为了建立只在内共生病毒上存在差异的2个种群，参照Chenetal.(2015，2019)的方法，将源于福建农林大学校园的柑橘木虱冷冻麻痹，用0.01 mol·L-1His-MgCl2(pH 6.2) 缓冲液研磨,用0.22 μm滤头过滤上清液中的杂质、细菌和真菌，制备病毒粗提液。

应用显微注射技术，按64 nL·头-1的剂量，将病毒粗提液注射于采自晋安区日溪柑橘园的柑橘木虱，并饲养至下一代。用RT-PCR方法确定注射种群中7种内共生病毒的稳定存在，确认注射种群与未注射的种群在内共生微生物上只存在7种内共生病毒的差别。将注射的种群命名为“注射组”，将未被注射的种群命名为“未注射组”，用于下一步试验。

1.5 成虫产卵量和寿命的测定

分别收集注射组与未注射组的40头新羽化的雌虫，用单雌单苗法测试2个种群的产卵能力和寿命。具体方法如下：

采集九里香嫩稍，单株插入盛满水的EP管中，用Parafilm membrane封口，制备单苗食源。将每个食源放入50 mL的玻璃试管中，并放入1头雌虫和1头雄虫。用捕虫纱网封口离心管。每头雌虫编号。

每隔3 d观察雌虫的存活情况，做好记录，并回收取食过的食源。对存活的雌虫，更换新鲜食源，并及时补充雄虫。显微镜下统计回收食源上的卵粒数，并记录。重复上述操作，直至雌虫死亡。

1.6 数据处理

数据采用Excel软件处理分析。用Graphpad 6.0软件中双尾t检验分析所有重复数据的平均值和标准差值。

2 结果与分析

2.1 转录组序列分析和组装

利用Illumina测序平台对柑橘木虱转录组进行测序，组装获得的clean reads，共有57441个转录本(transcripts)，序列信息达到107700364 bp，平均长度1205 bp，N50长度为3123 bp。在转录本基础上进一步组装获得22742条功能基因(unigenes)，长度为39029359 bp，N50长度为2838 bp。其中，长度超过1 kb 的unigenes有11612条，占51.06%。

2.2 基因功能注释

在组装获得的22742条 unigenes中，成功注释17673条，注释率为77.71%。其中，NR注释到的unigenes基因中，相似性在95%以上的基因占26.8%。从匹配的物种来源分析，柑橘木虱转录组测序拼接的unigenes与Genbank数据库的柑橘木虱unigenes相似性最高，达到67.7%；其次与烟粉虱BemisiatabaciGennadius、褐飞虱NilaparvatalugensStål和湿木白蚁ZootermopsisnevadensisHagen等的相似性分别为5.9%、3.2%和2.5%；另外与其他物种同源的基因占17.0%。

2.3 基因功能分类

柑橘木虱转录组中，有29893条(48.19%)unigenes被GO注释至生物学过程(biological process)的26个功能亚类；13076条(21.08%)unigenes注释至分子功能(molecular function)；19066条(30.73%)unigenes归属于细胞组分(cellular component)的10个功能亚类(图1)。

在生物学过程中，注释至细胞过程(cellular process， GO: 0009987)的unigenes数量最多，为6214条(20.78%)；注释到代谢过程(metabolic process， GO: 0008152)的unigenes数量较多，为5322条(17.80%)；注释到单生物过程(single-organism process， GO: 0044699)的unigenes为4870条(16.29%)；其余均在4000条以下，其中注释至行为(behavior， GO: 0007610)、节律性过程(rhythmic process， GO: 0048511)和解毒过程(detoxification， GO: 0098754)的unigenes 仅有17(0.06%)、13(0.04%)和7条(0.02%)。

分子功能类型中，注释至蛋白结合活性(binding， GO: 0005488)和催化活性(catalytic activity， GO: 0003824)的unigenes分别有6148 (47.02%)和4344条(33.22%)；注释至转运活性(transporter activity， GO： 0005215)的unigenes达1041条(7.96%)；其余功能亚类均在400条以下，其中，被注释至金属伴侣蛋白活性(metallochaperone activity， GO： 0016530)的unigenes仅有5条(0.04%)。

细胞组分功能类型中，注释至细胞(cell， GO： 0005623)和细胞部分(cell part， GO： 0044464)的unigenes均为4507条(23.63%)；注释至细胞器(organelle， GO： 0043226)、大分子复合物(macromolecular complex, GO: 0032991)、细胞膜(membrane， GO： 0016020)、细胞膜部分(membrane part， GO： 004 4425)和细胞器部分(organelle part， GO： 00444 22)的unigenes分别为2493 (13.08%)、2240 (11.75%)、2279 (11.95%)、2119 (11.11%)和1370条(7.19%)；其余被注释的功能亚类均在1000条以下。

2.4 内共生病毒的分析

根据转录组和siRNA拼接序列的基因注释进行分析，发现在福建农林大学种群中，共有15种病毒的核酸序列，福州晋安区日溪柑橘园种群中，共有11种病毒的核酸序列，并且这些序列可以在柑橘木虱体内复制。其中，2个种群有相同的病毒8种，包括Canarypox virus、Choristoneura occidentalis granulovirus、Diaphorina citri densovirus、Lactococcus phage bIL312、Diaphorina citri retrovirus、Shamonda virus、Synechococcus phage S-CBS1和Wolbachia phage WO；福建农林大学种群有7种单独的病毒Hubei tick virus 2、NLRV、MRCV、Synechococcus phage S-RSM4、Tokyovirus A1 DNA、DcRV、DcPLV isolate BR1，福州晋安区日溪柑橘园种群有3种单独的病毒Pandoravirus dulcis、Diaphorina citri bunyavirus和Prochlorococcus phage P-SSM3。

用RT-PCR方法扩增了福建农林大学种群7种单独的病毒的序列(图2)，并测序，确认序列的存在和正确性。

2.5 7种内共生病毒对柑橘木虱产卵能力的影响

为分析福建农林大学校园柑橘木虱种群7种内共生病毒对柑橘木虱繁殖力和存活力的影响，将提自该种群的病毒粗提液注射到福州晋安区日溪柑橘园的柑橘木虱体内。待下一代成虫羽化后，应用PCR或RT-PCR确认这7种内共生病毒可在柑橘木虱种群内稳定地垂直传播，从而确立种群，并命名为“注射组”。将未注射的福州晋安区日溪柑橘园的柑橘木虱种群命名为“未注射组”。

用单雌单苗法统计注射组和未注射组柑橘木虱的产卵量。研究发现，注射组产卵量总体低于未注射组的产卵量。在产卵第12、18、21、24和27 天，注射组的3日平均产卵量显著低于未注射组(图3A)；注射组的单雌总产卵量显著低于未注射组，说明7种内共生病毒可显著降低单雌总产卵量(图3B)；注射组的单雌日产卵量、单雌寿命与未注射组的无显著差异(图3C、D)，说明7种内共生病毒对单雌日产卵量及雌虫寿命无显著影响。

3 讨论

本研究初步明确了柑橘木虱体内基因功能的种类。将全部unigenes序列与七大数据库进行功能注释，获得的17673条unigenes(77.71%)成功被注释，仍有50696条(22.29%)未被注释，其原因可能是由于unigenes较短，未与公共数据库中的序列比对上(孟翔等，2016)，也有可能是存在很多功能未知的新基因(Ho & Tzanetakis,2014)。与NR数据库进行比对，结果表明,与柑橘木虱同源序列最多。

图2 扩增7种内共生病毒基因组序列片段 的琼脂糖凝胶电泳结果Fig.2 Agarose gel electrophoresis of partly genomic sequences of 7 viral endosymbionts M: Marker; 1: DcRV; 2: NLRV; 3: MRCV; 4: Hubei tick virus 2; 5: Synechococcus phage S-RSM4; 6: DcPLV isolate BR1; 7: Tokyovirus A1 DNA.

图3 注射组和未注射组的雌虫产卵量和单雌寿命统计分析Fig.3 Analysis of female fecundity and lifespan of injected group and uninjected group A: 3日平均产卵量;B:单雌总产卵量;C:单雌日产卵量;D:单雌寿命分析。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；ns:差异不显著。 A: Average number of eggs laid every 3 days; B: Total number of eggs laid by per female; C: Average number of eggs laid per day; D: Average lifespan of female.*p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001; ns: The indicators are not significantly different (p>0.05).

GO功能富集结果显示，柑橘木虱参与生物进程的unigenes最多，其中前3个类别分别是细胞、代谢和单生物进程。在分子功能中，unigenes 数量最多的3个类别是结合、催化和转运活性。与白背飞虱SogatellafurciferaHovarth(邓瑶等,2018)和烟粉虱(邵若玄,2017)的研究结果较一致，与携带马铃薯斑马病菌CandidatusLiberibactersolanacearum和未携带病菌的马铃薯木虱BactericeracockerelliSulc转录组的聚类结果一致(Hurst & Hutchence,2010)。

对siRNA序列分析和拼接发现，采集自福建农林大学和福州日溪柑橘园的2个种群中含有8种相同和10种不同的内共生病毒种类。且siRNA的存在证明这些病毒在柑橘木虱体内是可以增殖的活病毒，并且能引起柑橘木虱RNA沉默的抗病毒反应。根据传统的病原物过滤方法，用0.22 μm的滤头过滤上清液中的细菌、真菌和杂质，可以获得活病毒(Chenetal.,2015，2019)。用显微注射法将病毒接种柑橘木虱，是遵循病理学的柯赫氏法则：将提自带病宿主的病原物回接至无病宿主。虽然显微注射过程会导致当代少部分柑橘木虱的机械死亡，但是用于研究成虫产卵量和寿命的是被注射虫的下一代，因此,应用显微注射的方法对本研究的数据影响较小。而接种的病毒与原病毒是否有拮抗作用或相互促进作用的可能性，还有待分子生物学层面的进一步研究。

病毒与昆虫的共生关系十分普遍，它们对宿主的生长发育不产生明显的负面影响，还能提高宿主昆虫免疫、繁殖能力(Roossinck，2008)。这种关系是它们长期共同进化、相互作用的结果。认识昆虫的内共生病毒，有助于了解宿主的免疫耐受机制，或是病毒逃避宿主免疫的机制。内共生病毒在进化上具有重要意义，它们改变和塑造宿主的基因组，对物种的形成分化至关重要。寄生蜂LeptopilinaboulardiBarbotin,Carton and Kelner-Pillault体内的内源病毒Lpopli系组Boulardi filamentous virus (LbFV)能影响雌性果蝇的行为，感染LbFV病毒的雌虫更容易被诱发超寄生现象，受病毒感染的雌性产下的后代明显比无毒雌虫多(Varaldietal.,2015)。携带内共生病毒Pteromalus puparum negative strand RNA virus 1 (PpNSRV-1) 的寄生蜂，成虫寿命明显长于不携带该病毒的昆虫，并且该病毒能够改变后代的性别比例，使雄性后代比例增多(Wangetal., 2017)。棉铃虫被densovirus(HaDNV-1)侵染后幼虫生长速率加快，幼虫孵化率、雌虫生长发育和寿命提高，说明该共生微生物有利于宿主昆虫的自然繁殖(Xuetal.，2014)。果蝇种群被果蝇C病毒Drosophila C virus (DCV)、Cricket paralysis virus (CrPV)和Flock house virus (FHV)侵染后，携带共生微生物Wolbachia的果蝇寿命明显长于没有携带共生微生物的果蝇(Hedgesetal.,2008)。本研究发现，7种内共生病毒DcRV、Hubei tick virus 2、NLRV、MRCV、Synechococcus phage S-RSM4、Tokyovirus A1 DNA和DcPLV isolate BR1可显著降低柑橘木虱雌虫群体总产卵量，但是对单雌日产卵量以及单雌寿命无影响，说明柑橘木虱的内共生病毒影响了宿主的繁殖力。但是这种影响机制和途径目前尚不清楚，亟待进一步研究。