发酵中药对蛋鸡生长性能、抗体水平及肠道菌群的影响

石建存，李继开，贾 琳，吕建存，商子涵，张 铁，王春光

(1.石家庄市栾城区职业技术教育中心，石家庄 051430；2.河北农业大学动物医学院，保定 071000；3.石家庄市农业综合行政执法支队，石家庄 050025)

应用新型微生物技术开发中药已经成为养殖业发展的必然趋势。中药作为天然植物经微生物发酵后会提高药效、降低毒性、产生新成分，可作为绿色饲料添加剂更好地替代抗生素[1]。中药因其来源于天然物质、毒副作用低、不良反应小等深受国内外学者的关注[2-3]，其含有众多对动物的生产和免疫力有着广泛影响的活性成分[4]。益生菌含有丰富的营养物质，可以在肠道内通过和致病菌互作来抵御致病菌对肠道黏膜的黏附，调节菌群平衡，影响黏膜免疫。此外，益生菌的代谢产物可以增加肠道的屏障功能，抑制炎症反应及调节免疫反应，实现维持和改善健康以及降低某些疾病的风险。微生物发酵中药将两者有机结合起来，通过益生菌的代谢产物和酶解作用使中药活性成分大大增加[5]。中药经过发酵后可改变理化特性，进而提高适口性和消化利用率，在提高动物生长性能、增强免疫力、改善肉质水平等方面都取得良好的效果。李宗杰[6]用多种益生菌发酵混合中药粉剂，采用饮水方式饲喂肉鸡，结果表明发酵中药能明显提高肉鸡的生长性能和免疫指标。近年来，传统中药作为免疫增强剂往往单独应用于畜禽，且中药经过发酵后的效果优于纯中药。李欣泽等[7]在肉鸡饲粮中添加纯中药与发酵中药后，结果显示，肉鸡的平均日采食量均有所提高，料重比均有所降低，其中发酵中药组检测指标均优于中药组。现有研究主要集中于单菌对中药进行发酵，其作用效果不能最大限度地发挥出来，且与单一菌株发酵相比，双菌混合发酵会产生更好的发酵性能。因此，本试验选用具有增强免疫力、提高生产性能的植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌对黄芪、绞股蓝、马齿苋组成的中药组方进行混菌发酵，并按一定比例添加在鸡饲料中，观察其对鸡的生长性能、抗体水平和肠道菌群的影响，以期为禁抗后鸡的高效、绿色、天然、无残留的饲料添加剂研发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1日龄科宝蛋鸡公雏购自大午集团有限公司；植物乳杆菌购自广东省微生物菌种保藏中心；枯草芽孢杆菌购自广东环凯微生物科技有限公司；黄芪、绞股蓝、马齿苋均购自河北安国药材市场；黄芪多糖购自北京索莱宝科技有限公司；鸡新城疫活疫苗La Sota株购自瑞普生物药业有限公司。

1.2 方法

1.2.1 试验菌种的活化与平板计数 将植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌分别于相应的固体培养基平板上划线接种，在37 ℃恒温培养箱中培养24 h，挑取单菌落接种于装有5 mL相应液体培养基的试管中，植物乳杆菌培养温度为37 ℃，静态培养；枯草芽孢杆菌的培养温度为37 ℃，在150 r/min摇床上进行培养。 将培养菌液分别吸取100 μL接入5 mL相应的液体培养基中培养24 h，获得发酵用种子液，4 ℃备用。 经平板计数，植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌的菌落总数分别为1.5×108和2.0×108CFU/mL。

1.2.2 复方中药液的制备 分别取黄芪、绞股蓝、马齿苋3种中药经过超微粉碎后，过300目筛，制备发酵中药培养基：复方中药粉(3种中药粉按1∶1∶1混合)10 g、过60目筛黑豆粉(提供氮源)3 g、葡萄糖(提供碳源)2 g、100 mL蒸馏水，灭菌备用。

1.2.3 发酵中药的制备 取制备好的复方中药液置于发酵罐中，加入植物乳杆菌与枯草芽孢杆菌发酵种子液，以中药发酵液中粗多糖得率(苯酚-硫酸法测定)为指标，通过单因素试验及正交试验确定发酵工艺参数：接菌比例2∶1、接种量4%、发酵温度37 ℃、发酵时间48 h，按此工艺制备发酵中药液。

1.2.4 试验设计 将84只1日龄试验鸡预饲13 d，14日龄开始正式试验，试验鸡随机分为7组，每组单笼饲养，每笼12只，分别为空白对照组(A组)，复方中药组(B组)，发酵中药低剂量组(C组)、中剂量组(D组)、高剂量组(E组)，发酵菌液组(F组)，对照药物黄芪多糖组(G组)。试验期间，鸡自由采食与饮水，记录每日给料量和剩料量。试验第1(14日龄)、14(28日龄)、28(42日龄)天清晨空腹称重，计算各阶段平均日增重(average daily gain，ADG)、平均日采食量(average daily feed intake，ADFI)及料重比(feed to gain ratio,F/G)。用鸡新城疫活疫苗La Sota株进行免疫，试验第7、14、21、28天翅下静脉采血，用于抗体效价检测。动物分组及给药剂量详情见表1，按设计的给药剂量添加于饲粮中进行搅拌混饲。

表1 动物分组及给药剂量

续表

1.2.5 血清抗体效价检测 用血凝和血凝抑制(HA-HI)试验检测鸡血清NDV抗体效价，通过HA试验测定出4单位抗原，检测各样本的抗体效价，其血清抗体效价采用log2表示[8]。

1.2.6 肠道菌群的检测 试验结束后选取同等给药剂量的空白对照组、复方中药组、发酵中药中剂量组、发酵菌液组及对照药物黄芪多糖组，每组无菌采取5只鸡的盲肠内容物，编号后放入10 mL离心管，立即放入液氮中保存，采样结束后-80 ℃保存，送上海派森诺公司进行肠道菌群测序(16S rDNA高通量测序)。为了能较为全面地评估微生物群落的Alpha多样性，本流程以Chao1和Observed species指数来度量每个样品中物种的菌群相对丰度，以Shannon和Simpson指数来度量每个样品中物种的菌群多样性。应用mother软件分析每个样品在OTU列表中的物种丰度，统计和分析各组的生物多样性指数。通过QIIME软件对各样本进行物种分类学组成分析，主要目的是统计每组中各个样品具体的菌群结构。通过统计物种分类学组成分析表，绘制各样本在门、纲、目、科、属、种等分类水平上的组成分布柱状图。将OTU数据进行对数处理后绘制物种聚类热图，可通过物种聚类热图的不同颜色来表示表格中的数据信息，更加直观地展示肠道微生物菌群在种类和数量上的差异。每个样品的物种丰度由热图上相对应的色块来代表，每个样品在群落组成的相似性和差异性通过颜色深度的变化来反映。

1.2.7 数据处理与统计 试验数据用SPSS 21.0软件处理分析。结果用平均值±标准差来表示，采用Excel统计学软件进行统计学绘图。采用One-Way ANOVA进行方差分析，再通过Duncan氏法进行多重比较，P<0.05表示差异显著；以P<0.01表示差异极显著；P>0.05表示差异不显著。

2 结 果

2.1 发酵中药对鸡生长性能的影响

由表2可知，试验第1～14天，D、E组鸡的ADFI均极显著高于A、F、G组(P<0.01)；C、D、E组的ADG均有所升高，其中E组的ADG极显著高于A、F组(P<0.01)，显著高于B、G组(P<0.05)，D组的ADG显著高于A、F组(P<0.05)；F、G组的F/G最低，极显著低于其他各组(P<0.01)，且B组的F/G显著高于A、C、E组(P<0.05)。试验第15～28天，C、E组的ADFI均显著高于B、F组(P<0.05)；B组的ADG极显著高于其他各组(P<0.01)，E组的ADG显著高于A组(P<0.05)；B组的F/G极显著低于其他各组，D、E、F、G组极显著低于A组(P<0.01)。

2.2 发酵中药对鸡血清抗体效价的影响

由表3可知，试验第7天，各组鸡血清抗体效价均无显著差异(P>0.05)；试验第14天，各组鸡血清抗体效价达到试验全期的峰值，且E组显著高于A、F、G组(P<0.05)；试验第21、28天，E组鸡血清抗体效价高于其他各组，且显著高于A组(P<0.05)。表明发酵中药高剂量能显著提高鸡血清中新城疫的抗体滴度。

表2 试验各阶段鸡的生长性能

表3 各组鸡血清抗体效价(log2)

2.3 发酵中药对鸡肠道菌群的影响

2.3.1 盲肠微生物Alpha多样性分析 由表4可知，D组的Chao1和Observed species指数最高，说明其菌群相对丰富度最高，但与其他组间无显著性差异(P>0.05)。

表4 各组鸡盲肠肠道Alpha多样性系数

2.3.2 盲肠物种分类学组成分析

2.3.2.1 门水平分类学组成 图1中主要体现相对丰度比例排在前10的菌门，其他所有菌门在图中用Others来表示，其中相对丰度较大的菌门主要包括厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)、柔壁菌门(Tenericutes)和蓝藻门(Cynaobacteria)等，每组样品中厚壁菌门和拟杆菌门的相对丰度比例最高，占总微生物量的98%以上，属于鸡肠道内最常见的细菌类群。5个组别样品中厚壁菌门和拟杆菌门的相对丰度见表5。由表5可知，A组的厚壁菌门相对丰度最高，显著高于D和G组(P<0.05)；拟杆菌门相对丰度最低，显著低于D和G组(P<0.05)。门水平上各组物种丰度聚类热图见图2，其中厚壁菌门占比较高。

图1 门水平上各组物种分布图Fig.1 The distribution of species in each group at the phylum level

表5 各组厚壁菌门和拟杆菌门的丰度比例

图2 门水平上各组物种丰度聚类热图Fig.2 Clustering heat map of species abundance in each group at the phylum level

2.3.2.2 属水平分类学组成 由图3可知，各组的主要菌有粪便菌属(Faecalibacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、颤螺菌属(Oscillospira)、拟杆菌属(Bacteroides)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、链球菌属(Streptococcus)、劳特氏菌(Blautia)、巴恩斯氏菌属(Barnesiella)及丁酸杆菌属(Butyricicoccus)等，其中巴恩斯氏菌属(Barnesiella)为G组盲肠所特有，且占比较高。各组前5种菌属的相对丰度见表6。由表6可知，各组粪便菌属、乳杆菌属、颤螺菌属和瘤胃球菌属均无显著差异(P>0.05)，其中D组拟杆菌属的相对丰度显著高于A和F组(P<0.05)。属水平上各组物种丰度聚类热图见图4，其中巴恩斯氏菌属占比较大。

图3 属水平上各组物种分布图Fig.3 Distribution of species in each group at the genus level

表6 各组样品中菌属的丰度比例

图4 属水平上各组物种丰度聚类热图Fig.4 Cluster heat map of species abundance of each group at the genus level

3 讨 论

3.1 发酵中药对鸡生长性能的影响

生长性能是衡量发酵中药在鸡上应用是否有效的最重要指标，中草药在动物机体代谢过程中会提供丰富的营养物质。本试验选用的发酵菌是植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌，具有益生作用，可促进动物生长[9]。所用中药黄芪性味甘，补肺健脾，具有补气消肿之功效；绞股蓝具有补益元气、生津健脾、平喘等功效；马齿苋味酸、性寒，主治热痢脓血，具有解毒消炎的功效[10-12]。这些中药经过微生物发酵后可促进药材细胞壁的裂解，提高多糖含量，而中药多糖能促进肠道消化分泌物及微生物的产生，增强免疫，从而达到提高禽类生长性能的目的[13-15]。李萌等[16]研究表明，将用微生态制剂配制的发酵中药饲料饲喂鸡，其平均日增重显著提高。汪鹏[17]以枯草芽孢杆菌对健鸡散进行发酵后应用于白羽肉鸡，结果显示对其采食量有很好的促进效果。本试验结果与上述研究结果一致，在鸡饲粮中添加发酵中药可提高适口性，进而提高鸡的采食量和日增重。由此可见，发酵中药可提高鸡的生长性能。

3.2 发酵中药对鸡抗体效价的影响

抗体效价的高低水平是衡量机体体液免疫功能的重要指标，决定鸡群的抵抗力及感染程度。中药多糖具有促进抗体产生、增强免疫调节等重要作用[18]。抗体是由效应B细胞分泌的蛋白质，主要通过抗体的分泌来参与机体的免疫反应，抗体效价水平可反映免疫能力的高低及体液免疫的状态。温建新等[19]研究表明，将2株乳酸杆菌以不同剂量灌服雏鸡，再进行新城疫免疫后，各组抗体水平均显著或极显著高于对照组，对雏鸡免疫机能有促进作用。张进隆等[20]研究表明，在鸡饲粮中添加不同剂量复方中药，能明显提高抗鸡新城疫抗体水平，且特异性抗体水平的高低与复方中药的添加剂量呈正相关，本试验结果与其一致，在发酵中药3个剂量组之间，抗体水平随着剂量的增加而提升。本研究中，试验第7天，各组鸡血清抗体水平差异不显著，其原因可能是各组还没有产生相应的抗体和药效；试验第14、21、28天，发酵中药高剂量组鸡血清抗体效价高于其他组，显著高于空白对照组。发酵中药在不同试验中应用效果并不一致，其原因可能与发酵菌种、活菌数量和发酵工艺等有关。

3.3 发酵中药对鸡肠道菌群的影响

机体对营养物质的消化吸收主要是在胃肠道中进行，且肠道对入侵的致病菌有一定的防御功能。肠道菌群是促进动物生长发育的重要因素，其代谢活性受多种外界因素的影响，鸡肠道内各种微生物菌群影响着宿主的多项生理机能[21-22]。在鸡消化道内，由于胃肠液的冲刷作用使得机体的前端肠段微生物数量较少，而盲肠肠段的封闭性环境能够更长时间地储存内容物[23]，其内部的微生物菌群丰富程度较高。机体的免疫系统能通过肠道中的大量细菌进行调控。研究表明，添加益生菌会使生物体肠道微生物多样性增高，通过改善机体肠道菌群组成以减少肠道疾病[24]。厚壁菌门和拟杆菌门是禽类盲肠中最具优势的菌群，其主要在宿主营养物质的消化吸收和机体生理学中起到非常重要的作用[25]，本试验中，各组所有样本的厚壁菌门和拟杆菌门相对丰度比例最高，占总微生物量的98%以上。厚壁菌门类菌群能够促进肠道内的多糖发酵[26]，拟杆菌门类菌群主要参与机体的多种重要代谢活动，促进机体对脂类、蛋白、多糖等物质的消化吸收。本试验运用高通量测序方法检测鸡盲肠中门水平与属水平上微生物分布情况，结果显示，发酵中药提高了鸡盲肠中的群落丰富度，显著提高了鸡盲肠中拟杆菌门和拟杆菌属的相对丰度。因此，将发酵中药应用于鸡，能够调节肠道菌群平衡，给机体带来积极影响。

4 结 论

在本试验条件下，中、高剂量发酵中药可提高鸡的平均日采食量和平均日增重，降低料重比；高剂量发酵中药可显著提高血清中新城疫抗体效价，且发酵中药在一定程度上能够增加鸡盲肠中菌群的物种多样性。