中国草原红牛PDK4基因多态性及其与肉质性状的关联分析

马彦茹,于永生，曹 阳，秦立红，赵玉民,3,4,5，吴 健,3,4,5

(1.吉林农业大学动物科学技术学院，长春 130118；2.吉林省农业科学院，公主岭 130033；3.农业农村部肉牛遗传育种重点实验室，公主岭 136100；4.农业农村部东北种牛性能测定中心，公主岭 136100；5.吉林省肉牛繁育及养殖技术科技创新中心，公主岭 136100)

肌内脂肪(IMF)是影响牛肉品质的重要因素[1]。适量的IMF可以增强肉质特性，如风味、多汁性和嫩度[2-3]。目前，消费者对牛肉尤其是肌内脂肪含量丰富的牛肉需求呈现刚性增长。中国草原红牛是采用英国短角牛(Shorthorn)与本地牛杂交培育出的具有耐粗饲、抗病力强、适应性强等优良特性的肉乳兼用型品种[4-5]，随着多年的培育中国草原红牛已具有生产高档牛肉的潜力。

丙酮酸脱氢酶激酶4(pyruvate dehydrogenase kinase 4，PDK4)是丙酮酸脱氢酶激酶(PDK)的4种亚型之一。线粒体丙酮酸脱氢酶复合物(PDC)催化丙酮酸的氧化脱羧，并将糖酵解与三羧酸循环和ATP产生联系起来[6]。PDK4通过磷酸化丙酮酸脱氢酶(PDH)来灭活PDC，使丙酮酸转化乙酰辅酶A(acetyl-CoA),进而影响糖酵解、三羧酸循环和ATP形成[7]。Rowles等[8]研究表明，在饥饿、运动和糖尿病病人中,PDK4活性在大多数组织中都会升高,而且发现在人和鼠的心脏和骨骼肌中的表达量最高。White等[9]发现，PDK4对脂肪代谢和葡萄糖代谢起重要调节作用，发现PDK4在运动中根据能量需求会发生变化，推测PDK4可以调节机体能量代谢途径，从而影响机体运动性能。曹行等[10]通过基因多态性研究发现，PDK4基因突变与赛马速度之间存在显著差异，对伊犁马耐力性能具有明显的影响。赵伟明等[11]研究发现,PDK4基因在2种牛背膘脂肪中的表达量不同，表明PDK4基因可能与脂肪沉积相关。肉牛遗传育种重点实验室课题组前期通过全转录组测序技术检测出大量参与肉牛脂代谢的基因，其中发现PDK4基因的表达水平随着成脂分化天数的增加而增加(未发表)。 因此，本研究利用Sanger直接测序法分析PDK4基因多态性，并与中国草原红牛肉质性状进行关联性分析,以期筛选与肉质性状相关的分子标记，为今后中国草原红牛的分子育种和品种改良提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

试验用中国草原红牛均来自吉林维多利农牧业有限公司，选取120头20月龄阉割中国草原红牛，该批中国草原红牛均在同一饲养环境下饲养。

1.2 主要试剂和仪器

DL2000 DNA Marker购自TaKaRa公司;动物组织DNA提取试剂盒购自Axygen公司;2×TaqMaster Mix购自CWBIO公司、Quawell-Q5000 超微量分光光度计购自北京鼎盛生物科技有限公司；PCR仪购自上海伯乐生命医学产品有限公司；DYY-6C电泳仪购自北京市六一仪器厂。

1.3 肉质性状测定

120头中国草原红牛屠宰后测定眼肌面积，采集背最长肌进行熟肉率、嫩度、失水率和肌内脂肪含量等肉质性状指标的测定，具体测定方法参照肉牛生产性能测定技术规范(NY/T 2660-2014)[12]。

1.4 DNA提取

试验牛屠宰后采集肝脏组织，-80 ℃保存。利用DNA试剂盒提取120头中国草原红牛肝脏组织基因组DNA，并使用超微量分光光度计检测DNA的浓度及纯度。-20 ℃保存备用。

1.5 引物设计及合成

参考NCBI中牛PDK4基因(登录号：NM_001101883.1)，利用Primer Primer 5.0软件设计11对引物用于扩增其11个外显子(表1)。引物均由苏州金唯智生物科技有限公司进行合成。

表1 引物信息

续表

1.6 PCR扩增

随机挑取20个中国草原红牛肝脏组织DNA样品进行混池，以此为模板对PDK4基因11个外显子进行PCR扩增。PCR反应体系20 μL：DNA 模板1 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 8 μL，2×TaqMasterMix 10 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，退火30 s(温度见表1)，72 ℃延伸(时间见表1)，共34个循环；72 ℃终延伸5 min；4 ℃保存。利用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，阳性PCR产物送至苏州金唯智生物科技有限公司进行Sanger直接测序。

1.7 中国草原红牛PDK4基因多态性检测

利用DNAMAN、Chromas软件对测序结果进行分析比对，对有突变位点的外显子以单个个体DNA为模板进行PCR扩增后测序，记录测序结果，统计基因型频率及基因频率。

1.8 统计学分析

计算遗传多态性指标，包括有效等位基因数(Ne)、遗传纯合度(Ho)、多态信息含量(PIC)和遗传杂合度(He)，并利用卡方适合性检测进行Hardy-Weinberg平衡检验，利用SPSS 21.0软件进行单因素方差分析，采用邓肯氏(Duncan’s)多重比较法分析中国草原红牛不同基因型间肉质性状的差异。结果以平均值±标准差表示，P<0.05表示差异显著。

2 结 果

2.1 中国草原红牛PDK4基因PCR扩增

中国草原红牛PDK4基因11个外显子均扩增出特异性条带，且均与目的条带一致。图1为PDK4基因第8和11外显子扩增的特异性条带。

M,DL2000 DNA Marker；1～3，PDK4基因第8外显子PCR扩增产物；4～6，PDK4基因第11外显子PCR扩增产物M,DL2000 DNA Marker；1-3,PCR amplification product of exon 8 of PDK4 gene;4-6,PCR amplification product of exon 11 of PDK4 gene图1 中国草原红牛PDK4基因PCR产物电泳图Fig.1 Electrophoresis of PCR products of PDK4 gene in Chinese Steppe Red cattle

2.2 测序结果分析

通过DANMAN和Chromas软件对测序结果进行分析，发现PDK4基因第8和11外显子均存在突变位点。在PDK4基因第8外显子存在1个突变位点：G57C(图2A)，存在GG、GC和CC 3种基因型，且G57C引起了编码氨基酸的错义突变，由谷氨酰胺突变为谷氨酸；第11外显子存在2个突变位点：G330T和C389T(图2B和2C)，G330T位点存在GG、GT和TT 3种基因型；C389T位点存在CC、CT和TT 3种基因型，这两处突变均未引起编码氨基酸的改变。

A,G57C；B,G330T；C,C398T图2 中国草原红牛PDK4基因外显子不同基因型测序峰图Fig.2 Sequencing peaks of different genotypes of PDK4 gene exon in Chinese Steppe Red cattle

2.3 中国草原红牛PDK4基因3个突变位点的遗传学分析

由表2可知，中国草原红牛PDK4基因第8外显子的G57C位点,CC、CG和GG基因型频率分别为0.033、0.067和0.900。C和G基因频率分别为0.066和0.934，其中GG基因型为优势基因型,G为优势等位基因;第11外显子的G330T位点,TT、GT和GG基因型频率分别为0.100、0.333和0.567;T和G基因频率分别为0.267和0.733，其中GG基因型为优势基因型,G为优势等位基因；第11外显子的C389T位点,TT、CT和CC基因型频率分别为0.233、0.067和0.700;T和C基因频率分别为0.267和0.733，其中CC基因型为优势基因型,C为优势等位基因。卡方适合性检验结果显示,中国草原红牛G57C位点偏离Hardy-Weinberg平衡状态(P<0.05),G330T和C398T位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。由表3可知，G57C属于低度多态性位点(PIC<0.25)，G330T和C389T均属于中度多态位点(0.25

表2 中国草原红牛PDK4基因多态位点的基因型频率和基因频率

表3 中国草原红牛PDK4基因多态位点的遗传多样性分析

2.4 PDK4基因多态性与中国草原红牛肉质性状的关联分析

由表4可知,PDK4基因G57C位点GG和CC基因型个体肌内脂肪含量显著高于GC基因型(P<0.05)，其余性状在不同基因型间均无显著差异(P>0.05)；G330T位点GG基因型个体肌肉嫩度显著高于TT基因型(P<0.05)，GG和TT基因型个体滴水损失和初水分量均显著高于GT基因型个体(P<0.05)，而肌内脂肪含量显著低于GT基因型个体(P<0.05)；C389T位点CC和CT基因型个体失水率显著低于TT基因型个体(P<0.05)。

3 讨 论

目前，对PDK4基因的研究主要集中在癌症、糖尿病及代谢综合征等领域[13-18]。在家畜研究方面，有研究表明，PDK4的表达水平与蒙古马的运动关系密切[19]，伊犁马群体中存在的g.38973232位点多态性与耐力运动性能有极显著影响[10]。另外，PDK4基因在卵母细胞成熟、胚胎着床、温度适应性方面也有重要作用[20-23]，其表达量在不同品种猪的不同组织中也存在差异[24-27]。目前在牛研究领域，有研究显示，PDK4的表达水平与泌乳早期代谢特性、肉牛背最长肌的最终pH具有一定的关联性[28]。但PDK4基因多态性与肉牛肉质的关联缺乏文献报道。

Sanger测序法作为第3代分子标记技术，与传统鉴别技术相比，其检测的是单核苷酸的突变，突变频率较低，遗传稳定性相对较高[29]。本研究利用Sanger测序法对中国草原红牛PDK4基因外显子的多态性进行了检测，在第8外显子发现了G57C突变，第11外显子上发现了G330T和C389T突变。对中国草原红牛群体的遗传变异程度进行了分析，发现这3个多态性位点的杂合度均低于纯合度，G330T、C389T位点的杂合度接近0.4，有效等位基因数均在1.6以上，多态信息含量在0.3以上，属于中度多态，均高于G57位点。表明G330T、C389T位点多态性相对丰富且具有一定的选择潜力。与在早胜牛群体中钙蛋白酶I(CAPN1)基因多态性位点的遗传变异程度相近[30]。卡方适合性检验结果显示,G57C位点偏离Hardy-Weinberg平衡状态,这可能是持续性选择、遗传突变等因素造成了这一偏离。G330T和C398T符合Hardy-Weinberg平衡状态，说明这2个位点人工选择程度较小。中国草原红牛PDK4基因第8外显子在G57C位点CC基因型肌内脂肪含量显著高于GC基因型；第11外显子G330T位点GG基因型滴水损失和初水分量显著高于GT基因型；GG基因型肉嫩度显著高于TT基因型；GT基因型肌内脂肪含量显著高于TT基因型，C389T位点CT基因型失水率显著低于TT基因型，表明PDK4基因的多态性位点与中国草原红牛熟肉率、嫩度、肌内脂肪、持水力等肉质性状相关。张浩等[31]发现PDK4可影响山羊的脂质沉积。上述结果说明PDK4基因是肌肉品质相关的功能基因之一。本研究结果可为中国草原红牛的后续选育提供一定的数据支持。

4 结 论

在中国草原红牛PDK4基因第8和11外显子上发现3个突变位点，分别为G57C、G330T和C398T位点，G57C位点突变引起编码氨基酸的改变，谷氨酰胺突变为谷氨酸，属于错义突变，其不同基因型显著影响中国草原红牛的肌内脂肪含量；G330T不同基因型对中国草原红牛滴水损失、初水分量、肉嫩度、肌内脂肪含量均有显著影响；C389T不同基因型显著影响中国草原红牛的失水率。