CTGF、Gprin3基因多态性及其与牦牛体尺性状的关联分析

柴志欣，武志娟，王吉坤，张成福，钟金城，信金伟

(1.西南民族大学，青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部重点实验室，成都 610041；2.省部共建青稞和牦牛种质资源与遗传改良国家重点实验室，拉萨 850000)

结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)属基质蛋白，为即刻早期基因家族成员，在许多生理生化过程中发挥重要作用。Almendral等[1]于1988年首次发现CTGF，Bradham 等[2]于1991年首次分离获得CTGF，且CTGF在进化上较为保守，不同种属间CTGF基因及其编码蛋白均表现出高度同源性。CTGF由349个氨基酸组成，氨基端含促分泌信号肽，且包括IB结构域-胰岛素样生长因子特异结合区、VWC结构域-C型血管假性血友病因子区、TSP-1结构域、Cysteine-Knot结构域等[3-4]。CTGF可促进新血管生成、骨骼发育、软骨发生和损伤修复等[5-7]，其丝裂原活性较强，也可促进有丝分裂，参与许多细胞活动，刺激细胞增殖、分化和凋亡，维持细胞基质内环境稳态等[8]。在正常生理状态下，动物体内CTGF表达量很低或不表达，但在胚胎阶段、骨发生发育过程中出现CTGF高表达，表明CTGF存在表达的自身调节[9-10]。CTGF的表达调控涉及到骨骼发育，骨形态发生蛋白诱导的转化生长因子β(TGF-β)由Wnt信号通路上调CTGF表达量，CTGF通过整合素(αvβ1)整合增强成骨细胞的黏附，并促进细胞通过细胞骨架重组和小G蛋白Rho GTP ase家族成员(Rac1)的激活进行迁移[11-12]。

G蛋白调节诱导神经突增生家族(G protein-regulated inducer of neurite outgrowth family,Gprin)是具有组成型活性形式的共表达信号传导分子，主要包括Gprin1、Gprin2和Gprin3，成员间具有高度同源性。Gprin抗体已广泛应用于神经生物学和信号转导领域的研究，G蛋白偶联受体(Gαo)可刺激神经分支细胞，但其在体内的作用机制尚不清楚。Gprin可能是Gαo调节神经生长的下游作用因子[13]，Gαo-GRIN相互作用可调节神经突增生，使细胞通过G蛋白偶联受体i/o亚型(GPCR-Gαi/o)介导的信号分化为神经突起。研究发现，Gαi/o-Gprin信号能够调节神经元的定向迁移，可显著调控神经元在胚胎阶段的迁移和分化，从出生后到成熟阶段发挥定位功能并维护特定的神经系统，在神经元中特异表达并定位于树突和轴突，且与Gαo互作的Gprin蛋白很可能参与信号转导途径和神经元分化过程[14-16]。

牦牛的体尺性状是评估其生长发育的重要指标，同时也间接反映了牦牛的生长速度和产肉性能，是重要的经济性状之一[17]。目前，对人、小鼠及大鼠等模式动物的CTGF基因研究较多，在其他物种上研究相对较少；Gprin3基因的相关研究主要集中于人类疾病方面，但以上基因突变对家畜生长发育性状的影响鲜见报道。CTGF基因缺失会引起软骨发育不全，而牦牛软骨发育不全会导致头部畸形、短脊椎、主轴骨和附属骨发育不良及腿短等疾病[18]；Gprin3基因缺失可引起细胞通讯异常导致生长激素分泌减少进而影响其个体生长发育。鉴于此，本试验拟研究CTGF和Gprin3基因多态性，并分析其与牦牛生长性状的关联性，以期为牦牛定向选育提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 样品采集

选取健康成年的斯布牦牛、帕里牦牛、类乌齐牦牛、申扎牦牛、麦洼牦牛共260头(表1)，采集耳组织，75%乙醇保存带回实验室，-80 ℃保存备用，并在采集过程测定其体重、体高、体斜长、胸围、管围、前肢长和胫长等指标。

表1 牦牛样本信息

1.2 主要试剂及仪器

DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；TaqGreen PCR Master Mix和琼脂糖均购自Thermo公司；DL2000 DNA Marker购自Biomiga公司。PCR仪购自Thermo公司；紫外分光光度计和凝胶成像系统均购自Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 制备DNA池 每个试验牦牛群各取30个样品，提取DNA，重复测定DNA浓度，取其3次测定结果的平均值，将其稀释到50 ng/μL，150个DNA样本各取5 μL混合均匀，4 ℃静止48 h。

1.3.2 PCR扩增 根据GenBank中普通牛CTGF基因序列(登录号：AC000166)、野牦牛Gprin3基因序列(登录号：NW_005393912)，采用Primer Premier 6.0软件分别设计引物，引物信息见表2。 引物均由上海伯津生物技术有限公司合成。

PCR扩增体系25 μL：上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板(200～600 μg/L) 1 μL，2×LongTaq预混酶(0.625 U) 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR扩增程序：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性30 s，退火(退火温度见表2)30 s，共30个循环；72 ℃延伸8 min；4 ℃保存。 PCR扩增产物经1.0%凝胶电泳检测，对鉴定正确的产物纯化回收后送上海伯津生物技术有限公司测序。

1.3.3 SNP筛查及数据分析 利用BioEdit 7.0、Chromas软件将扩增序列与参考序列进行比对，筛查双峰位点(SNP)，使用直接测序法验证其突变位点；根据突变位点及双峰图碱基型，结合软件DNA SEQMAN判定其基因型，计算基因频率及基因型频率；采用PIC_CALC软件分析多态信息含量(PIC)，利用Popgen32软件计算其纯合度(Ho)、杂合度(He)及有效等位基因数(Ne)，并进行Hardy-Weinberg平衡性检测；使用Excel对体重、体高、体斜长、胸围及管围等体尺数据进行整理，采用SPSS 17.0软件对数据进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)与相关性分析，结果以平均值±标准误表示，以P<0.05为差异显著性判断标准。

表2 引物信息

2 结 果

2.1 PCR产物检测

以DNA池为模板进行PCR扩增，所得产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，条带清晰单一(图1)，片段大小与预期相符。经测序发现，牦牛CTGF基因的引物P3和P4以及Gprin3基因引物P1、P2和P3的扩增序列均含SNPs位点。

2.2 SNPs位点筛查及检测

以5个牦牛类群DNA池为模板扩增CTGF、Gprin3基因，在CTGF基因中共检测到3个SNPs，分别为T1537A、C2195T和C2421T(图2)，均包含3个基因型，位于内含子区；在Gprin3基因中共检测到4个SNPs，分别为G310C、C414T、C1100T和G1213A(图3)，均包含3个基因型，位于编码区。

2.3 基因频率和基因型频率

分别对CTGF、Gprin3基因SNPs进行统计分析，获得了等位基因及基因型在5个牦牛类群中的分布频率，结果见表3、4。由表3可知，CTGF基因T1537A位点TT基因型在斯布牦牛、帕里牦牛、类乌齐牦牛、申扎牦牛和麦洼牦牛中的分布频率分别为0.6000、0.4516、0.4286、0.4857和0.7714，为优势基因型，等位基因T为优势等位基因；C2195T位点中C等位基因在5个牦牛类群中的频率均高于T等位基因；C2421T位点纯合基因型CC在斯布牦牛、帕里牦牛、类乌齐牦牛、申扎牦牛和麦洼牦牛中的分布频率分别为0.5750、0.7097、0.6531、0.7000、0.7857，为优势基因型。

由表4可知，在Gprin3基因G310C位点中未发现CC基因型个体；C414T位点在申扎牦牛中未发现TT基因型个体，该位点的CC基因型在5个牦牛类群中均属于优势基因型；C1100T位点在帕里和申扎牦牛中均未检测到TT基因型个体；G1213A位点在5个牦牛类群中均缺失AA基因型，且等位基因G频率最高，为优势等位基因。

1～4，CTGF基因P3引物PCR扩增产物；M,DL2000 DNA Marker;5～7，CTGF基因P4引物PCR扩增产物；8、9，Gprin3基因P3引物PCR扩增产物；10～12，Gprin3基因P2引物PCR扩增产物；13～15，Gprin3基因P1引物PCR扩增产物1-4，PCR amplification products of CTGF gene P3 primer；M,DL2000 DNA Marker;5-7，PCR amplification products of CTGF gene P4 primer；8 and 9，PCR amplification products of Gprin3 gene P3 primer；10-12，PCR amplification products of Gprin3 gene P2 primer；13-15，PCR amplification products of Gprin3 gene P1 primer图1 牦牛CTGF和Gprin3基因PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification results of CTGF and Gprin3 genes in yaks

图2 牦牛CTGF基因测序峰图Fig.2 Sequencing of CTGF gene in yaks

图3 牦牛Gprin3基因测序峰图Fig.3 Sequencing of Gprin3 gene in yaks

表3 CTGF基因SNPs位点基因型频率及基因频率

表4 Gprin3基因SNPs位点基因型频率及基因频率

2.4 Hardy-Weinberg平衡检测

对牦牛CTGF、Gprin3基因SNPs位点不同基因型分布进行Hardy-Weinberg平衡的χ2检验，结果见表5。由表5可知，CTGF基因T1537A位点在斯布牦牛和麦洼牦牛类群中均处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)，而在帕里牦牛、类乌齐牦牛和申扎牦牛类群中均偏离Hardy-Weinberg平衡状态(P<0.05)；C2195T和C2421T位点在5个牦牛群体中χ2值均未达到显著水平，均处于Hardy-Weinberg平衡状态。Gprin3基因G310C、C414T及C1100T位点在5个牦牛类群中均处于Hardy-Weinberg平衡状态；G1213A位点在类乌齐牦牛类群中偏离平衡状态，在其余4个类群中均达到Hardy-Weinberg平衡状态。

2.5 遗传多样性指标

由表5可知，CTGF基因T1537A位点在斯布牦牛、帕里牦牛、类乌齐牦牛和申扎牦牛类群中均处于中度多态(0.25

由表5可知，CTGF基因T1537A、T2421T位点及Gprin3基因G310C、C1100T位点在5个牦牛类群中纯合度较高，说明西藏牦牛的遗传一致性较高，遗传变异较低；Gprin3基因C414T、G1213A位点在类乌齐牦牛类群中杂合度均高于纯合度，而在其他类群中纯合度均高于杂合度，说明类乌齐牦牛的遗传多样性较高。

表5 CTGF、Gprin3基因SNP位点的遗传多样性

2.6 CTGF、Gprin3基因SNPs位点与牦牛体尺性状的相关性分析

由表6、7可知，CTGF基因T1537A和C2421T位点与牦牛体尺性状具有相关性，其中T1537A位点TT和TA基因型个体体重均显著高于AA基因型(P<0.05)；在斯布牦牛和申扎牦牛两个类群中，C2421T位点CC和CT基因型个体体重、体斜长、胸围和前肢长均显著高于TT基因型，CT基因型个体管围显著低于CC、TT基因型(P<0.05)。

由表8、9可知，Gprin3基因C414T和C1100T位点与牦牛体尺性状具有相关性，其中C414T位点CC和CT基因型个体牦牛体重、体斜长和胸围均显著高于TT基因型，CC基因型个体牦牛体高显著高于CT和TT基因型(P<0.05)；在斯布牦牛和申扎牦牛中，C1100T位点CC基因型个体胸围和前肢长均显著低于CT和TT基因型(P<0.05)。

表6 CTGF基因T1537A位点对牦牛体尺性状的影响

表7 CTGF基因C2421T位点对牦牛体尺性状的影响

表8 Gprin3基因C414T位点对牦牛体尺性状的影响

表9 Gprin3基因C1100T位点对牦牛体尺性状的影响

3 讨 论

3.1 牦牛CTGF、Gprin3基因多态性

CTGF基因在骨骼发育、塑形及软骨发生等过程中均发挥一定调控作用[19]，而骨骼的发育及重塑可间接反映家畜的体型及生长发育状况，影响着家畜的经济性状及经济价值。 目前，CTGF基因多态性研究大多集中在人类疾病方面，如CTGF基因rs2648875位点多态性与2型糖尿病性肾病遗传易感性(DKD)相关[20]，rs9399005位点多态性与冠心病有关[21]等。在动物方面的研究则主要集中于动物疾病及其模型构建，黄叶等[22]构建了广西巴马小型猪CTGF基因真核表达载体；丁旭娜等[23]研究显示，外源转化生长因子β(transforming growth factor β，TGF-β)对奶牛乳腺上皮细胞中CTGF基因表达的促进作用可进一步作用于奶牛乳腺纤维化过程。 牦牛CTGF、Gprin3基因的相关研究较少，向娅等[24]对牦牛Gprin3基因进行了克隆及组织表达分析，李月娇等[25]开展了CTGF、FGF-2基因在不同年龄牦牛肺脏内的分布和表达研究，而关于家畜CTGF、Gprin3基因SNP位点检测及与相关性状的关联分析鲜有报道。

本研究在CTGF、Gprin3基因中共发现7个SNPs，其中CTGF基因中3个SNPs均位于内含子区域；Gprin3基因中4个SNPs均位于外显子区域，均包括3种基因型。在所检测的等位基因中，T、C、G较为普遍，而等位基因A频率较低，这可能与不同牦牛类群人工选育程度及不同地区对牦牛优势生产性能筛选差异有关。Hardy-Weinberg平衡检测结果表明，CTGF基因中除T1537A位点在帕里牦牛、类乌齐牦牛、申扎牦牛中偏离平衡状态外，其余位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态；Gprin3基因中仅G1213A位点在类乌齐牦牛中不符合Hardy-Weinberg平衡状态，其余位点在5个牦牛类群中均处于Hardy-Weinberg平衡状态，说明以上位点受自然选择和基因突变的影响较大，同时类乌齐牦牛于2017通过国家畜禽遗传资源委员会审定为优良牦牛遗传资源，2019年被认定为国家特色农产品，对类乌齐牦牛核心育种群的选育及短期育肥基地的建立加大了人工选择的干预，而帕里牦牛于2006年进入国家禽遗传资源保护名录，并对其进行了核心群选育，人工选择使其群体结构有所改变，表现出部分群体多个位点不同程度地偏离Hardy-Weinberg平衡状态，但对不同畜种而言适度的人工干预有利于其生产性能的提高。CTGF、Gprin3基因多态位点在类乌齐牦牛类群中均处于中度多态，说明类乌齐牦牛遗传变异程度较大，多态性较丰富，与武志娟等[26]对西藏牦牛mtDNA 16S rRNA的遗传多样性研究结果一致，显示在西藏11个牦牛类群中类乌齐牦牛遗传多样性最丰富。CTGF基因T1537、T2421T位点及Gprin3基因G310C、C1100T位点在5个牦牛类群中的纯合度较高，说明以上位点的纯合基因型积累较多，且遗传变异较小，用于优良性状选育的潜力较小，可能与以上牦牛类群长期本品种选育及缺少与其他牦牛群体的基因交流有关[27]。

3.2 CTGF、Gprin3基因多态性与牦牛体尺性状的关联性

本研究结果显示，CTGF基因T1537A位点与体高呈显著相关，其中TT和TA基因型个体体重均显著高于AA基因型，是影响牦牛体重的参考分子标记位点；在斯布牦牛和申扎牦牛中，CTGF基因C2421T位点与牦牛体重、体斜长、胸围、管围和前肢长均呈显著关联，其中CC和CT基因型个体体重、体斜长、胸围和前肢长均显著高于TT基因型，推测CTGF基因在牦牛生长发育相关过程中发挥重要调控作用。申扎牦牛因其体格较小在西藏当地称为矮小牦牛，群体个体体型均较小，其体重、体高、体斜长、胸围、管围等指标均低于帕里牦牛、类乌齐牦牛和麦洼牦牛；而斯布牦牛大多数个体后驱股部发育欠佳，2个牦牛群体个体发育除受所处生态环境影响外，基因调控也起到重要作用，后续可对CTGF基因对牦牛体尺性状的影响开展相关研究。CTGF基因中3个SNPs位点均位于内含子区域，这与Chang[28]研究表明内含子也可通过影响基因的表达来影响动物表型的结论一致。虽然内含子区域的变异并不直接涉及蛋白质结构的改变，但是内含子区域的突变很可能与某些突变位点的不平衡状态有关，大多数复杂性状的遗传变异均位于基因间和内含子区域，参与相关基因的表达调控，但却并不影响蛋白质的结构。可变剪切可调控基因的表达和产生蛋白质多样性，目前研究发现内含子也可参与可变剪切调控，改变蛋白质的结构进而影响动物的相关性状[27]。在本研究5个牦牛类群中，Gprin3基因C414T位点与牦牛体重、体高、体斜长和胸围均呈显著相关，其中CC和CT基因型个体牦牛体重、体斜长和胸围均显著高于TT基因型；在斯布牦牛和申扎牦牛中，C1100T位点CC基因型个体胸围和前肢长均显著低于CT和TT基因型。推测这2个SNPs位点可能是影响牦牛体尺性状的重要调控位点，但具体调控机制和功能尚需进一步研究。目前关于CTGF、Gprin3基因在家畜中的研究较少，缺少可供参考及对比的数据，可进一步从蛋白质组水平分析以上2个基因与性状的相关性。

4 结 论

本研究中CTGF和Gprin3基因在牦牛中存在丰富的多态性，共检测到7个SNPs位点，其中CTGF基因T1537A位点与牦牛体高显著相关，C2421T位点与牦牛体重、体斜长、胸围、管围和前肢长呈显著相关；Gprin3基因C414T位点与牦牛体重、体高、体斜长和胸围均呈显著相关，C1100T位点与牦牛胸围和前肢长均呈显著相关。