促性腺激素抑制激素对SD大鼠性腺生殖功能与糖代谢的影响

胡 文，霍孔林，宋星星，张 鑫，张多妮，罗荣荣，徐文镐，李 珣

(广西大学动物科学技术学院，南宁 530004)

促性腺激素抑制激素(GnIH)是动物体内重要的神经内分泌激素，由Tsutsui等[1]于2000年首次在鹌鹑的下丘脑中分离得到，其可通过抑制促性腺激素(GnRH)的合成和释放而影响性腺的发育，同时调控动物的生殖。后续研究还发现了一种与GnIH互为同源的具有酰胺结构的神经肽，研究人员将其命名为RF酰胺相关肽3(RFRP-3)[2]。GnIH在动物体内生殖系统广泛分布和表达。Zhang等[3]研究发现，睾丸和卵巢中均有GnIH的表达，说明GnIH作为一种神经肽参与调控机体内生殖系统的生理活动。Muoz-Cueto等[4]研究发现，GnIH会影响动物的摄食；Ubuka等[5-6]研究表明，GnIH对动物的性行为和能量代谢等方面都有影响。Ubuka等[7]进一步证实了GnIH还影响动物性腺的生长、发育。Huo等[8]首次证实了GnIH参与大鼠的糖代谢稳态调控并导致葡萄糖耐量受损。目前，研究已初步验证了GnIH参与了大鼠的糖代谢并影响了其生殖功能，但是对于GnIH在其中的作用机制尚未进一步阐述。因此，本研究通过对SD大鼠腹腔注射不同剂量的GnIH，使用HE染色、实时荧光定量PCR等技术更深入地探索GnIH对SD大鼠性腺生殖功能和糖代谢的影响，并分析生殖功能和糖代谢之间的相关性，为进一步探索GnIH在动物生殖和能量代谢中的作用机制的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

大鼠GnIH(048-46)购自Phoenix Pharmaceuticals公司；Trizol、RNA酶抑制剂、反转录酶、TaqDNA聚合酶、PCR Master Mix及2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix均购自南京诺唯赞生物科技有限公司。电子分析天平(BSM-520.3)购自上海卓精电子科技有限公司；实时荧光定量PCR仪(Light Cycler 96)购自Roche公司；轮转式切片机(RM2235)购自Leica公司。

1.2 试验动物饲养管理、分组及处理

5周龄SD大鼠36只(雌雄各半)，体重为(190±10)g，购自广西医科大学实验动物中心。SD大鼠采用单笼饲养，自由采食和饮水，饲养环境控制在统一标准下(温度：24 ℃±2 ℃，湿度：50%±10%，光照控制：12L+12D，每天早上07:00开灯)。适应饲养7 d后，参考Huo等[8]的方法将SD大鼠随机分为对照组(0.9%生理盐水)、1 μg/100 μL GnIH(Ⅰ组)、10 μg/100 μL GnIH(Ⅱ组)，每组12只，雌雄各半。每天07：00和19：00注射生理盐水或GnIH，200 μL/次，连续注射14 d。14 d后，先称量体重，再麻醉[9]处死，分别取出卵巢和睾丸并称重，将一部分样品置于4%多聚甲醛溶液中固定，一部分放入液氮速冻处理后移入-80 ℃保存备用。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 肥胖程度 称量SD大鼠初始体重和处死前体重，肥胖程度=终体重-初始重。

1.3.2 卵体比和睾体比 按如下公式计算大鼠的卵体比和睾体比[10]。

卵体比=卵巢重量/体重

睾体比=睾丸重量/体重

1.3.3 卵巢和睾丸组织切片 取4%多聚甲醛溶液中固定的卵巢和睾丸样品，制作石蜡切片，HE染色，中性树脂封片后显微镜下观察。

1.3.4 发情周期 采用阴道涂片法[11]，连续14 d在注射时用棉签沾取大鼠的阴道分泌物(每天07：00和19：00各1次)，将其均匀地涂抹在含有0.9%生理盐水的载玻片上，自然晾干后进行HE染色，显微镜下观察。根据阴道涂片的细胞变化特点来区分不同的发情周期阶段，分别为发情前期、发情期、发情后期和发情间期4个阶段组成。具体判断方法如下：发情前期主要为上皮细胞；发情期主要为无核多边形细胞，还有少量上皮细胞；发情后期主要特征是白细胞大量出现；发情间期上皮细胞、无核多边形细胞、白细胞均可见。

1.3.5 精子活力 处死大鼠后，立即取出附睾，将附睾内的精子用移液枪吸出，将精子放入滴有0.9%生理盐水的载玻片上，小心吹打混匀，盖上盖玻片后，显微镜下观察。根据显微镜下活跃精子与全部精子的百分比判断各组精子的活力[12]。

精子活力(%)=活跃精子数/总精子数×100%

1.3.6 糖代谢及炎症相关基因的检测 按照Trizol法提取各组卵巢和睾丸组织总RNA，反转录合成cDNA。根据GenBank中胰岛素受体(IR)、葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素(IL-1β)和β-actin基因的序列，用Primer Premier 5.0软件设计引物，引物均由深圳华大基因科技有限公司合成。引物具体信息见表1。以β-actin为内参基因，进行实时荧光定量PCR。 PCR反应体系20 μL：TaqDNA聚合酶10 μL，上、下游引物各0.4 μL，模板1 μL，ddH2O 8.2 μL。PCR反应条件:95 ℃预变性2 min；95 ℃变性30 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s,共38个循环。采用2-ΔΔCt法计算所检测基因mRNA相对表达量。

表1 引物信息

1.4 SD大鼠性腺生殖功能与糖代谢之间的相关性分析

通过SPSS 22.0软件分析腹腔注射不同浓度GnIH组的SD大鼠性腺生殖功能(发情周期和精子活力)与糖代谢(GLUT4与IR基因的表达)之间的皮尔逊指数和P值[13-14]。将雌性SD大鼠性腺中的卵体比、发情周期的指标与糖代谢相关因子IR、GLUT4基因的表达水平进行相关性分析；将雄性SD大鼠性腺中的睾体比、精子活力的指标与糖代谢相关因子IR、GLUT4基因的表达水平进行相关性分析。皮尔逊指数的范围在-1到1之间，通过数值的正负判断两者为正相关还是负相关，P值的大小判断相关性是否显著。P<0.05为显著相关。

1.5 数据统计分析

用SPSS 17.0进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，用LSD法进行多重比较，结果用平均值±标准差表示。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结 果

2.1 GnIH对大鼠肥胖程度的影响

由图1可知，与对照组相比，Ⅰ组雌性大鼠的肥胖程度显著升高(P<0.05)(图1A)，Ⅱ组雄性大鼠肥胖程度显著升高(P<0.05)(图1B)。

肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；肩标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)；肩标相同字母表示差异不显著(P>0.05)。图6～9同Values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05);And with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01);While with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).The same as fig.6-fig.9图1 各组雌(A)、雄(B)大鼠肥胖程度Fig.1 Obesity degree of female (A) and male (B) rats in each group

2.2 GnIH对大鼠性腺表观指标的影响

由表2可知，与对照组相比，Ⅰ、Ⅱ组大鼠卵巢的大小均显著增加(P<0.05)，Ⅱ组大鼠卵巢重量和卵体比均显著增加(P<0.05),睾丸重量和睾体比均显著降低(P<0.05)，睾丸的大小没有显著变化(P>0.05)。

表2 各组大鼠性腺大小及性腺/体重

2.3 GnIH对大鼠性腺形态学的影响

2.3.1 GnIH对雌性大鼠卵巢组织形态的影响 由图2可知，与对照组相比，Ⅱ组大鼠卵巢中的卵泡呈囊性扩张，颗粒细胞层减少，卵泡腔增大。Ⅰ组无明显变化。

2.3.2 GnIH对雄性大鼠睾丸的影响 由图3可知，与对照组比较，Ⅰ组大鼠生精小管中出现“空泡样”改变，Ⅱ组睾丸切片“空泡样”改变比Ⅰ组更明显，并且Ⅰ与Ⅱ组都出现生精细胞排列紊乱、层次减少的变化。

□，局部放大。图3同□，Local amplification.The same as fig.3图2 各组雌性大鼠卵巢组织形态Fig.2 Ovarian tissue morphology of female rats in each group

图3 各组雄性SD大鼠睾丸组织形态Fig.3 Testicular tissue morphology of male rats in each group

2.4 GnIH对大鼠生殖功能的影响

2.4.1 GnIH对雌性大鼠发情周期的影响 发情周期的不同阶段可通过显微镜下阴道涂片(图4)细胞的种类进行推断。由表3可知，与对照组相比，Ⅱ组大鼠发情前期的持续时间显著增加(P<0.05)，而发情期、发情后期以及间情期无明显变化(P>0.05)。

A，发情前期；B，发情期；C，发情后期；D，发情间期A,Proestrus;B,Estrus;C,Metestrus;D,Diestrus图4 发情周期不同阶段的判断(100×)Fig.4 Judgement of each phase of estrous cycle (100×)

表3 各组雌性大鼠发情周期各阶段的持续时间

2.4.2 GnIH对雄性大鼠精子活力的影响 由表4可知，与对照组相比，Ⅱ组总精子数量显著下降(P<0.05)，Ⅰ、Ⅱ组活跃精子数均显著下降(P<0.05)，Ⅱ组活跃精子百分比显著降低(P<0.05)。由图5可知，与对照组相比，Ⅰ、Ⅱ组大鼠精子均未发现畸形、卷曲等形态变化。

表4 各组雄性SD大鼠的精子活力

A～C，分别为对照组、Ⅰ和Ⅱ组A-C,Control,Ⅰ and Ⅱ groups,respectively图5 各组SD大鼠精子形态(100×)Fig.5 Sperm morphology of rats in each group (100×)

2.5 GnIH对大鼠性腺糖代谢的影响

由图6可知，与对照组相比，Ⅱ组雌性大鼠IR基因表达量显著降低(P<0.05)、Ⅰ、Ⅱ组GLUT4基因表达量极显著下降(P<0.01)；Ⅰ、Ⅱ组雄性大鼠GLUT4基因的表达量均极显著下降(P<0.01,图7)，而Ⅰ、Ⅱ组IR基因表达量虽有下降，但均无显著性差异(P>0.05)。

2.6 GnIH对大鼠性腺炎症反应的影响

由图8可知，与对照组相比，Ⅰ组雌性大鼠卵巢中TNF-α和IL-1β基因的相对表达量均显著升高(P<0.05)，Ⅱ组TNF-α基因的相对表达量极显著升高(P<0.01)；由图9可知，与对照组相比，Ⅱ组雄性大鼠TNF-α基因的相对表达量极显著升高(P<0.01)，Ⅰ组IL-1β基因的相对表达量显著升高(P<0.05)。

图6 各组雌性大鼠卵巢中IR(A)和GLUT4(B)基因的相对表达量Fig.6 The relative expression of IR (A) and GLUT4 (B) genes in ovaries of female rats in each group

图7 各组雄性SD大鼠睾丸中IR(A)和GLUT4(B)基因的相对表达量Fig.7 The relative expression of IR (A) and GLUT4 (B) genes in testis of male rats in each group

图8 各组雌性大鼠卵巢中TNF-α(A)和IL-1β(B)基因的相对表达量Fig.8 The relative expression of TNF-α (A) and IL-1β (B) genes in ovaries of female rats in each group

图9 各组雄性大鼠睾丸中TNF-α(A)和IL-1β(B)基因的相对表达量Fig.9 The relative expression of TNF-α (A) and IL-1β (B) genes in testis of male rats in each group

2.7 SD大鼠性腺生殖功能相关指标与糖代谢相关基因的相关性分析

由表5可知，GnIH处理后，大鼠的卵体比与GLUT4基因的表达水平呈极显著正相关(P<0.01)，与IR基因的表达水平呈显著正相关(P<0.05)；卵巢的发情周期与GLUT4基因的表达水平呈极显著负相关(P<0.01)，与IR基因的表达水平无显著相关性(P>0.05)；大鼠睾体比与GLUT4基因的表达水平均呈显著正相关(P<0.05)；大鼠精子活力与GLUT4基因的表达水平均呈极显著正相关(P<0.01);大鼠睾体比、精子活力与IR基因无显著相关性(P>0.05)。

表5 大鼠性腺生殖功能相关指标与糖代谢的相关性分析

3 讨 论

GnIH作为广泛分布在动物体内的神经内分泌激素，能够刺激SD大鼠的食欲而增加其体重，如Tachibana等[15]研究发现，GnIH可有效地刺激SD大鼠的进食量；Huo等[8]研究发现，GnIH通过增加大鼠的食欲而增加体重。本试验结果显示，腹腔注射10 μg/100 μL GnIH后雌雄SD大鼠的体重均增加，且雌性SD大鼠的卵体比增加，雄性SD大鼠的睾体比下降，说明GnIH可能使SD大鼠的性腺发生生理性变化。HE染色结果显示，10 μg/100 μL GnIH组卵巢的卵泡发生囊性扩张，颗粒细胞层减少，卵泡腔增大；10 μg/100 μL GnIH组睾丸的生精小管有“空泡样”改变，并且生精细胞排列紊乱、层次减少，说明腹腔注射GnIH抑制SD大鼠性腺的发育。Johnson等[16]研究发现，GnIH能够抑制大鼠促黄体素(LH)的分泌从而影响性腺的功能；Singh等[17]研究发现，RFRP-3能抑制卵巢孕酮的合成从而抑制卵巢的功能。RFRP3/GPR147信号通路参与雌性大鼠青春期的发育和性成熟的过程[18]。GnIH神经元投射到下丘脑区域和细胞参与生殖功能[19]。本研究结果显示，雌性SD大鼠的发情周期紊乱，雄性SD大鼠的精子活力下降，说明GnIH对大鼠的生殖功能有抑制作用，具体表现为抑制雌性的排卵和雄性的精子活力，说明GnIH能直接作用于SD大鼠的性腺从而抑制睾丸或卵巢的活力。

随着研究的深入，Arble等[20]研究发现，GnIH参与了能量代谢的过程。有研究表明，肥胖大鼠下丘脑-垂体-性腺轴神经调控中枢的代谢水平整体处于抑制状态，从而影响糖代谢在体内的葡萄糖稳态。在外源GnIH[21]作用下，GLUT4基因在卵巢和睾丸中的表达下降。本试验结果显示，10 μg/100 μL GnIH组雌性SD大鼠卵巢中IR基因表达水平显著降低，1、10 μg/100 μL GnIH组雌雄性SD大鼠睾丸中GLUT4基因的表达量均极显著降低，说明腹腔注射GnIH使SD大鼠性腺的糖代谢功能紊乱，与上述试验结果一致。此外，张多妮等[22]研究显示，腹腔注射RFRP-3后大鼠脾脏内的TNF-α和IL-1β基因的表达量增高。本试验结果表明，腹腔注射GnIH后，雌雄大鼠性腺中TNF-α和IL-1β基因的表达水平均升高，说明大鼠性腺发生了炎性反应。Chabrolle等[23]研究发现，卵巢内葡萄糖浓度的变化会影响卵巢功能。本试验结果显示，雌性大鼠的卵体比、与糖代谢相关因子IR、GLUT4基因的表达水平呈极显著强相关，发情周期与GLUT4基因的表达水平呈极显著负相关，雄性大鼠睾体比、精子活力指标与糖代谢相关因子GLUT4基因的表达水平呈显著或极显著正相关，说明GnIH参与调控雌雄SD大鼠性腺的生殖功能与糖代谢过程，推测GnIH在这两者中间担任“信使”的功能，可作为它们之间的联络因子。

4 结 论

本研究结果显示，腹腔注射10 μg/100 μL GnIH后，大鼠体重增加，卵泡发生囊性扩张，生精小管有空泡样改变，发情周期紊乱，精子活力降低，性腺中糖代谢基因IR、GLUT4表达量除睾丸中IR基因表达无变化，其他均下降，炎症相关基因TNF-α和IL-1β的表达量均增加；除卵体比与IR基因有强正相关性之外，雌雄大鼠性腺的生殖功能(卵体比、发情周期、睾体比、精子活力)与糖代谢基因GLUT4之间均有强相关性。说明腹腔注射GnIH不仅能够抑制SD大鼠的生殖功能，导致糖代谢功能紊乱，而且GnIH可能参与性腺生殖功能和糖代谢之间的交叉对话，作为它们之间的一种新的联络因子而参与整个过程。