猪链球菌3型疫苗候选菌株筛选及3+9型二价灭活疫苗对小鼠免疫效果评估

李倩倩，龙云志，梁 巩，金 清，刘锦锦，杨 柳，黄 英，余道兵，宋文博，黄 超，汤细彪

(武汉科前生物股份有限公司，武汉 430000)

猪链球菌(Streptococcussuis,S.suis)是一种人畜共患病原菌，部分高致病性菌株不仅引起猪的脑膜炎、关节炎、败血症、肺炎或急性死亡等，且危害与养殖业密切相关的人群健康，引起人类脑膜炎、肺炎、感染性休克和死亡[1]。根据菌体荚膜多糖抗原性的区别，猪链球菌可分为35种血清型(1～34型和1/2型)，其中血清2型在猪群和患病人群中的分离率最高，血清3、7和9型分离率次之[2]。研究者对2002-2013年猪群中猪链球菌的血清型在全球的分布进行研究显示，从猪的临床病例中分离的猪链球菌主要血清型依次为2、9、3、1/2和7型，有15.5%的菌株无法分型，其中北美(加拿大和美国)流行的优势血清型为2和3型，南美(巴西)主要是2和1/2型，欧洲(荷兰和西班牙)主要是9和2型，亚洲(中国和韩国)主要流行2、3、4型等[3-4]。赵顾[5]对2017-2018年安徽省不同规模化猪场中分离的53株猪链球菌进行血清分型发现，3、2、8、9型的分离率依次为20.7%、18.9%、11.3%和9.4%，血清3型占有主导地位。王娟等[6]对广东地区1 326份样品的猪链球菌分离结果显示，以2型(16.58%)、3型(9.63%)和7型(6.95%)为主，其次为9型(5.34%)。王巍[7]从四川省12个市的猪场病料中分离出34株猪链球菌，经PCR鉴定发现2型最多，占47.1%；7和3型分别为26.5%和11.8%。Zhang等[8]对2013-2017年的中国猪场猪链球菌流行率的调查结果显示，中国猪链球菌主要为血清2、9和7型等，9型逐年持续增高，从2013年的12.1%升高至2017年的25.8%。不同地区优势血清型调查结果表明，猪链球菌血清3和9型在中国部分地区占据一定的地位，但目前对于血清3和9型猪链球菌的病原学研究很少，且尚无针对这2种血清型的疫苗。因此，本研究对发病猪病料进行猪链球菌血清3型分离培养和鉴定，通过蜡螟幼虫和BALB/c小鼠模型筛选疫苗候选菌株，制备猪链球菌3+9型二价灭活疫苗，评估其在BALB/c小鼠上的免疫保护效果，以期丰富猪链球菌的菌种库，为猪链球菌血清3型及多血清型联合防控提供材料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床病料及菌株 临床病料从武汉科前生物股份有限公司诊断中心获得。菌株ZYS为2005年四川资阳分离的猪链球菌血清2型菌株(SS2 ZYS),菌株YT为实验室前期筛选到的猪链球菌血清9型强毒株(SS9 YT),这2株菌均由武汉科前生物股份有限公司保存；商品化猪链球菌灭活疫苗(猪链球菌2+7型+马链球菌兽疫亚种)(武汉科前生物股份有限公司)。

1.1.2 主要试剂及仪器 胰酪大豆胨固体培养基(TSA)、胰酪大豆胨液体培养基(TSB)均购自BD Biotech公司；新生胎牛血清购自内蒙古金源康生物有限公司；革兰氏染液购自青岛海博生物技术有限公司；2×M5 HiPer plusTaqHiFi PCR Mix、第三代胶红核酸染料(M5 HiPure Next Ⅲ Gelred)均购自北京聚合美生物科技有限公司。

东胜龙PCR仪(型号：ETC811)购自苏州东胜兴业科学仪器有限公司；电泳仪(型号：DYY-8C型)购自北京六一生物科技有限公司；高速台式离心机(型号：H1850)购自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；DL-CJ-2ND Ⅰ洁净工作台购自北京东联哈尔仪器制造有限公司；恒温振荡器(SHZ-8-2)购自国华(常州)仪器制造有限公司；凝胶成像系统(型号：BG-GDSAUT0520)购自北京杰瑞恒达科技有限公司。

1.1.3 试验动物 蜡螟幼虫1 300只左右，体重0.2～0.3 g，购自武汉维物起源生物科技有限公司；SPF级6周龄体重18～22 g的健康雌性BALB/c小鼠330只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 猪链球菌分离鉴定 在超净工作台中无菌采集病料(心脏、肝脏、肾脏、肺脏、脾脏、淋巴结、关节液等)接种于TSA平板(含10%新生牛血清)上，37 ℃静置培养18～24 h。选取疑似链球菌形态的单菌落进行PCR鉴定、革兰氏染色、镜检，选取革兰氏染色阳性的、链状的单菌落继续在TSA平板上划线、传代。纯化后的菌株用50%甘油保存菌液，于-20 ℃保存备用。

1.2.2 菌体PCR鉴定 参照Liu等[9]根据荚膜多糖合成基因设计猪链球菌血清3型分型及鉴定引物(表1)。引物均由武汉擎科生物技术有限公司合成。用无菌接种环挑取TSA平板上菌落，置于50 μL PBS中，水浴煮沸10 min,冰浴2 min后离心取上清作为PCR模板。 PCR扩增体系10 μL：模板0.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，2×M5 HiPer plusTaqHiFi PCR Mix 5μL,用ddH2O补足10 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min；16 ℃终止反应。PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

表1 引物信息

续表

1.2.3 蜡螟初步筛选疫苗候选菌株 选取650只0.2～0.3 g蜡螟幼虫随机分为26组，24组分别注射猪链球菌血清3型临床分离菌株和猪链球菌血清2型ZYS菌株，同时设置PBS和空白对照组，每组25只；采用蜡螟最后尾足注射，注射剂量为25 μL/只，攻菌剂量为0.8×106～5.0×106CFU/只。攻菌后置于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中避光培养，持续观察7 d，每24 h记录蜡螟的死亡情况，蜡螟通体变黑，晃动平皿蜡螟不动即认为其死亡。该筛选试验重复2次，选取致死率较高的菌株通过BALB/c小鼠进行复筛。

1.2.4 BALB/c小鼠筛选疫苗候选菌株 选取170只BALB/c小鼠进行3轮猪链球菌血清型3型强毒株筛选，随机分为3组，分为猪链球菌血清3型临床分离株组、猪链球菌血清2型ZYS组、PBS对照组，每组10只；第1、2、3轮筛选均采用腹腔注射，各菌株的攻菌量分别为1.0×109～2.0×109、7.0×109～9.0×108和4.0×109～5.0×109CFU/只，注射剂量为200 μL/只。攻菌后连续观察7 d，记录小鼠死亡情况。

1.2.5 毒力基因检测 根据参考文献[10-12]，选择猪链球菌的主要毒力因子胞外蛋白因子(epf)、溶血素(sly)、溶菌酶释放蛋白(mrp)、纤连蛋白(fbps)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)、毒力相关因子(orf2)、89K毒力岛、谷氨酸脱氢酶(gdh)作为鉴定基因，合成8对引物，引物信息见表1。以筛选得到的1株强毒株DNA作为模板进行PCR扩增，从而确定强毒株的基因型。

1.2.6 生长曲线测定 无菌操作台中挑取 TSA 平板(含10%新生牛血清)上经过传代、纯化的单菌落，接种于10 mL TSB培养基(含 10%新生牛血清)中，37 ℃、200 r/min 培养5～8 h，作为种子液。将种子液按1%的比例接入30 mL TSB培养基(含10%新生牛血清)中，37 ℃、200 r/min培养，每1或2 h取出200 μL菌液于96孔板中，测量D600 nm值，每管重复3个孔，取平均值，绘制生长曲线。

1.2.7 BALB/c小鼠致病性试验 将菌株种子菌液按1%的比例转接于60 mL TSB培养基(含10%新生牛血清)中，37 ℃、200 r/min培养6 h，吸取100 μL菌液进行10倍倍比稀释，涂TSA平板，从而计算细菌密度。收集菌液，5 000 r/min离心10 min，弃去上清，用原培养基0.1倍体积的PBS重悬菌体。将40只BALB/c小鼠分为5组，每组8只，菌株设置4个浓度梯度，分别为2.2×109、2.2×108、2.2×107和2.2×106CFU/只进行腹腔注射攻毒，注射剂量为200 μL/只，同时设置PBS对照组(菌株浓度为0 CFU/只)。连续观察7 d，记录每组小鼠的死亡情况。

1.2.8 灭活菌株制备 将前期筛选的猪链球菌血清9型菌株YT和此次筛选的猪链球菌血清3型疫苗候选菌株进行复苏，从TSA平板上挑取单菌落到5 mL TSB液体培养基(含10%新生胎牛血清)中，37 ℃、200 r/min培养8～9 h，作为一级种子菌液；按2%的比例将种子菌液接种于TSB液体培养基(含10%新生胎牛血清)中，培养6～8 h；培养后菌液需进行活菌计数，确定猪链球菌血清3型菌株和猪链球菌血清9型菌株YT的量；按总体积加入0.3%甲醛溶液，37 ℃灭活15 h，然后对菌液进行灭活检测，取灭活菌液进行TSA平板和TSB液体培养，从而确定灭活是否彻底；将灭活后菌液4 ℃、8 000 r/min离心10 min获得菌体，用生理盐水清洗5遍，去除残留的甲醛溶液，最后用生理盐水调整浓度，制成所需浓缩的抗原液，浓缩抗原液中猪链球菌血清3型和猪链球菌血清9型菌株YT含量均为2×1010CFU/mL；对浓缩抗原进行无菌检测。

1.2.9 猪链球菌3+9型二价灭活疫苗制备 将无菌检测后的浓缩抗原液按猪链球菌血清3和9型菌株抗原液1∶1配比混合，然后将混合抗原液与Summit Poly Solution佐剂4∶1配比，从而制得猪链球菌3+9型二价灭活疫苗，疫苗中猪链球菌3和9型含菌量均为2×109CFU/mL。

1.2.10 临床观察 选取BALB/c小鼠30只，随机分为3组，每组10只。其中10只腿部肌内注射猪链球菌3+9型二价灭活疫苗，0.2 mL/只，连续观察7 d，同时设置空白对照组(不注射)和PBS组(注射等量PBS)。

1.2.11 免疫攻毒保护 选取BALB/c小鼠90只，随机分为3组，猪链球菌3+9型二价灭活疫苗组(3+9型二价灭活疫苗组)、商品化猪链球菌灭活疫苗(猪链球菌2型+7型+马链球菌兽疫亚种)组(商品化灭活疫苗组)和阴性对照组，每组30只。每只腿部肌内注射0.2 mL相应的疫苗，阴性对照组注射等剂量的PBS，免疫14 d后进行二免。二免14 d后，分别用猪链球菌血清2型ZYS菌株(2.0×108CFU/只)、筛选出的猪链球菌血清3型强毒株(2.0×108CFU/只)和猪链球菌血清9型YT菌株(8.0×107CFU/只)，腹腔注射攻毒，每个菌株注射10只，攻毒后观察7 d内小鼠的临床症状和死亡数。

2 结 果

2.1 细菌分离与鉴定

病料经37 ℃静置培养18～24 h后观察到灰白半透明色，针尖大小的光滑呈圆形的小菌落，在强光下可见浅蓝色荧光(图1A)，革兰氏染色呈阳性(图1B)。血清3型特异性引物及鉴定引物PCR扩增结果显示，分离出23株细菌均为猪链球菌血清3型，分别命名为KQ3-1～KQ3-23。部分PCR扩增结果见图2。

A，分离株菌落形态；B，分离株革兰氏染色(1 000×)A，Colony morphology of the isolates;B，Gram straining of the isolates (1 000×)图1 临床分离菌株菌落形态及革兰氏染色镜检结果Fig.1 Colony morphology and Gram staining microscopic examination results of the clinical isolates

①A,引物thrA；B，引物cps3L。②M，DL1000 DNA Marker;1～23,23株临床分离株;24,阴性对照(ddH2O)①A，thrA primer;B，cps3L primer.②M，DL1000 DNA Marker;1-23,23 strains of clinical isolates;24,Negative control (ddH2O)图2 分离菌PCR鉴定Fig.2 Identification of the isolates by PCR

2.2 蜡螟筛选疫苗候选菌株

蜡螟幼虫攻毒2次试验结果见表2。猪链球菌血清2型ZYS组的死亡率高达100%，PBS对照组死亡率为4%，空白对照组死亡率为0，各临床分离株组的死亡率不同。 选取2次筛选死亡率较高的6株菌进行后续BALB/c小鼠复筛，编号分别为KQ3-1、KQ3-4、KQ3-17、KQ3-19、KQ3-20和KQ3-22。

2.3 BALB/c小鼠筛选疫苗候选菌株

小鼠攻毒筛选试验结果见表3，根据第1次筛选死亡时间及死亡率，发现6株菌中有2株菌的死亡率均为100%，2株菌的死亡率在90%，2株菌死亡率分别为70%和80%。随即对死亡率>90%的4株菌进行第2、3轮筛选，根据攻菌量、死亡时间及死亡率发现KQ3-1株的致病性较强，死亡率为100%。

2.4 毒力基因鉴定

对猪链球菌KQ3-1株进行毒力基因扩增，结果见图3。由图3可知，扩增出大小分别为571、443和688 bp的gapdh、sly和gdh基因；未扩增出fbps、orf2、mrp、89K和epf基因，表明该菌株的基因型为gapdh+/sly+/fbps-/orf2-/mrp-/89K-/gdh+/epf-。

2.5 生长曲线测定

根据不同时间液体培养物中猪链球菌的密度变化绘制生长曲线，结果见图4。由图4可知，0～4 h为迟缓期，4～8 h为对数生长期，8～12 h为稳定期。表明菌株KQ3-1培养8 h左右液体培养基中细菌的密度最大，可获得大量的细菌抗原。

2.6 BALB/c小鼠致病性试验

试验小鼠感染KQ3-1菌株12 h内可引起小鼠精神萎靡、扎堆、毛发耸立、运动迟缓、死亡等临床症状，而对照组无明显症状。攻毒7 d后，每组小鼠的死亡情况见表4。根据改良寇氏法计算，KQ3-1菌株对BALB/c小鼠的LD50为5.2×107CFU/只。

①M，DL1000 DNA Marker;1、9，gapdh基因；2、10，sly基因；3、11，fbps基因；4、12，orf2基因；5、13，mrp基因；6、14，89K毒力岛；7、15，gdh基因；8、16，epf基因。②1～8，模板为ddH2O，9～16，模板为KQ3-1①M,DL1000 DNA Marker;1 and 9,gapdh gene;2 and 10,sly gene;3 and 11,fbps gene;4 and 12,orf2 gene;5 and 13,mrp gene;6 and 14,89K virulence island;7 and 15,gdh gene;8 and 16, epf gene.②1-8,Template was ddH2O;9-16,Template was KQ3-1图3 猪链球菌血清3型菌株KQ3-1毒力基因检测Fig.3 Identification of virulence genes of KQ3-1 strain

图4 KQ3-1菌株生长曲线Fig.4 Growth curve of KQ3-1 strain

表4 猪链球菌KQ3-1菌株攻毒后小鼠存活情况

2.7 抗原及疫苗无菌检测

将浓缩抗原和制备的疫苗同时用TSA和TSB培养基进行无菌检测，结果显示，TSA和TSB培养基中均无菌生长，空白对照的TSA和TSB培养基中均无菌生长，阳性对照的TSA和TSB培养基中有菌落生长，表明疫苗无菌检测合格。

2.8 安全性及免疫攻毒评估

疫苗组、空白对照组和PBS组注射前后小鼠无明显差别，精神状况、食欲均正常，触摸小鼠腿部注射部位无肿胀、硬块、结节等免疫反应，持续观察7 d全部存活，表明该灭活疫苗具有良好的安全性。

免疫后攻毒试验结果显示，采用猪链球菌血清2型ZYS菌株、猪链球菌血清3型KQ3-1菌株和猪链球菌血清9型YT菌株对阴性对照组、猪链球菌3+9型二价灭活苗组和猪链球菌灭活疫苗(猪链球菌2+7型+马链球菌兽疫亚种)组攻毒后，阴性对照组死亡率分别为90%、100%和100%，猪链球菌3+9型二价灭活苗组死亡率分别为70%、20%和30%，商品化猪链球菌灭活疫苗(猪链球菌2+7型+马链球菌兽疫亚种)组死亡率分别为30%、100%和90%(表5)。表明本试验疫苗对猪链球菌血清2、3和9型的保护率分别为30%、80%和70%，而商品化的灭活疫苗对猪链球菌菌血清2型保护效果为70%，对3和9型的保护率分别为0和10%；因此，研发的猪链球菌3+9型二价灭活苗能有效预防猪链球菌血清3和9型强毒株的感染。

表5 猪链球菌3+9型二价灭活疫苗效力试验结果

3 讨 论

目前猪链球菌疫苗主要分为灭活疫苗、弱毒活疫苗和亚单位疫苗。市售商品化疫苗主要猪链球菌病蜂胶灭活疫苗、猪链球菌病灭活疫苗(猪链球菌2型+马链球菌兽疫亚种)、猪败血性链球菌病活疫苗、猪链球菌病-副猪嗜血杆菌病二联灭活疫苗、猪链球菌病灭活疫苗(猪链球菌2+7型+马链球菌兽疫亚种)及猪链球菌灭活疫苗(2型，HA9801株)等[13]。由于猪链球菌血清型众多，灭活疫苗和弱毒活疫苗对多个血清型的保护能力有限，使得保护效果不理想。而单独以1种或几种毒力因子制成的亚单位疫苗不能起到完全的免疫保护效果，因此，灭活疫苗仍有着不可替代的作用。近年来猪链球菌血清2型在中国广泛存在并流行，成为当前危害中国养猪业的主要病原之一，也给公共卫生安全带来威胁。同时，猪链球菌血清3和9型也是优势血清型，呈上升的趋势[5-7,14-15]，而针对猪链球菌血清3、9型尚无相关的疫苗，给猪链球菌的防控带来了风险。因此，需要开发一种能预防猪链球菌血清3和9型的疫苗解决上述问题。

猪链球菌的生物学特性随着菌株和培养条件的变化而有所不同，不同菌株之间往往差异很大，分离新的致病性菌株，筛选免疫原性和安全性良好的疫苗菌株至关重要[16]。前期实验室已成功分离和筛选出猪链球菌血清9型的疫苗候选菌株YT，而猪链球菌血清3型疫苗候选菌株尚未获得。因此，本研究基于武汉科前生物股份有限公司诊断中心平台，以来自全国各地猪场送检的病料为材料，分离鉴定猪链球菌。通过对分离的细菌进行形态学观察、革兰氏染色、PCR鉴定确定菌种和血清型，获得23株猪链球菌3型临床分离株。进一步从23株猪链球菌菌株中鉴定出强毒株。动物模型是判断细菌毒力的重要工具，目前国际上尚无公认的标准的猪链球菌感染模型，而各个研究团队根据研究目的的不同建立了不同的动物模型。常用的动物感染模型主要包括斑马鱼模型、小鼠模型、豚鼠模型和仔猪模型[17]。此外，蜡螟幼虫已成功用于人类和动物传染病的研究，Velikova等[18]开发了该动物模型应用在猪链球菌毒力的评估。通过猪链球菌感染蜡螟幼虫、仔猪和斑马鱼模型，发现猪链球菌血清2型致病菌株对于蜡螟幼虫的毒力评估与仔猪和斑马鱼模型一致。蜡螟幼虫模型简单、快速、精确、成本低，可大规模使用，适合作为猪链球菌的感染模型。因此，通过蜡螟幼虫和BALB/c小鼠模型对23株猪链球菌血清3型进行筛选，筛选到1株强毒株KQ3-1。

为进一步了解KQ3-1株的生物学特性，试验对其生长曲线、毒力因子和致病性进行研究，结果显示，疫苗候选菌株KQ3-1培养8 h左右液体培养基中细菌密度最大，可获得大量的细菌抗原。毒力基因检测发现，基因型为gapdh+/sly+/fbps-/orf2-/mrp-/89K-/gdh+/epf-。Vecht15]研究发现，从发病猪体内分离的链球菌80%是mrp+/epf+型，而健康猪中86%是mrp-/epf-型[19]。KQ3-1株虽不携带强致病毒力基因mrp和epf基因，但BALB/c小鼠的致病性试验结果表明，KQ3-1株的致病性很强，LD50为5.2×107CFU/只。 不同毒力基因的组合对菌株的致病性具有一定影响[20]，KQ3-1携带3个毒力基因，对于每个基因在菌株致病性中发挥的作用仍需进一步探究。

利用本试验筛选的猪链球菌血清3型疫苗候选菌株KQ3-1和猪链球菌血清9型疫苗候选菌株YT制备的猪链球菌3+9型二价灭活疫苗对血清3和9型菌株的攻毒保护率为80%和70%，而商品化猪链球菌灭活疫苗(猪链球菌2+7型+马链球菌兽疫亚种)对血清3型菌株攻毒无保护效果，对血清9型菌株攻毒保护率为10%。而本试验制备的疫苗对血清3和9型的保护效果仍有待提高。疫苗制备中佐剂的选择和灭活方式也起着关键性的作用，选择合适的灭活方式和佐剂能将抗原的免疫原性发挥到最佳状态[21]。下一步试验将对不同的佐剂和灭活方式进行筛选，从而制备对猪链球菌血清3和9型具有更好免疫效果的疫苗。

4 结 论

本研究利用蜡螟和BALB/c小鼠模型从23株临床猪链球菌血清3型菌株中筛选出1株疫苗候选菌株KQ3-1，进而结合前期筛选的猪链球菌血清9型疫苗候选菌株制备了猪链球菌3+9型二价灭活疫苗，证明其在BALB/c小鼠模型上能有效预防血清3和9型强毒菌株的感染。