牡荆总黄酮提取工艺优化及其对产气荚膜梭菌抑菌活性研究

李亚晖，罗胜军，唐兴刚，袁明贵，魏琦麟，娄 华，向 蓉,3

(1.佛山科学技术学院生命科学与工程学院，佛山 528225；2.广东省农业科学院动物卫生研究所，农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站，广东省畜禽疫病防治研究重点实验室，广东省中兽药工程技术研究中心，广州 510640；3.岭南现代农业科学与技术广东省实验室茂名分中心，茂名 525000)

天然植物富含多种活性成分，如黄酮、多糖、生物碱、皂苷、挥发油等[1],这些活性物质大多具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗病毒和免疫调节等生物活性[2]，且具有天然环保无残留，毒副作用小等优点[3]，在当前养殖业减抗替抗的形势下成为替抗产品最佳选择之一，在养殖中已有大规模使用[4]。牡荆属植物(VitexL.)是马鞭草科(Verbenaceae)牡荆亚科植物[5]，在中国分布广泛，种类多样性丰富。牡荆属植物已被证实有抗炎镇痛、抗氧化、祛痰平喘、抑菌等药理作用[6]。国内外学者在牡荆属植物，尤其是该属穗花牡荆、黄荆等的化学成分和生物活性方面做了大量的研究，发现牡荆属植物含有大量的黄酮类[7]，是牡荆属植物中重要的活性成分，包括黄酮类(L1)和查耳酮(L2)等结构类型[8]。而目前在中国分布广泛的牡荆(VitexnegundoL. var.cannabifolia(Sieb. et Zucc.) Hand.-Mazz. (V.negundo))相关研究较少，其活性研究也不够深入。广东省农业科学院动物卫生研究所兽药研发中心课题组前期针对牡荆提取物化学成分分析的研究中已确定的成分以黄酮类化合物为主，鉴于植物中总黄酮易溶于有机溶剂[9]，本研究采用乙醇加热回流法提取牡荆中总黄酮，以乙醇浓度、提取时间、提取温度、料液比为因素，运用正交试验，确定牡荆提取物的最佳制备工艺，并探讨牡荆提取物对产气荚膜梭菌的抑菌活性，为牡荆提取物制剂的制备及应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 药物与菌株

牡荆采自广东省河源市，芦丁对照品(批号：A05GB144263)购自上海源叶生物科技有限公司，纯度≥98%；产气荚膜梭菌G型为广东省农业科学院动物卫生研究所兽药研究室冻存。

1.2 主要试剂及仪器

亚硝酸钠 (批号:20120314)、硝酸铝(批号:21050903-2)、氢氧化钠(批号:200514)、乙醇(批号：2019120203)、液体硫乙醇酸盐培养基(批号：028030)、胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂基础(批号：028020)均购自广州市丛源仪器有限公司。

UV1780紫外分光光度计购自苏州岛津仪器有限公司；00000246号万分之一电子天平购自北京赛多利斯科学仪器有限公司；HH-4数显恒温水浴锅购自常州奥华仪器有限公司；DHZ-3D旋转蒸发仪购自重庆雅马拓科技有限公司；SHZ-DⅢ循环水真空泵购自巩义市予华仪器有限责任公司。

1.3 溶液配制

精密称取芦丁标准品10.00 mg，置于10 mL容量瓶中，加60%乙醇适量，水浴40 ℃使其溶解，冷却至室温后加60%乙醇至刻度，摇匀，得芦丁储备液。精密量取5.00 mL芦丁储备液，置于25 mL容量瓶中，加60%乙醇稀释至刻度，摇匀，即得芦丁标准品溶液(含芦丁0.2 mg/mL)。精密称取牡荆粉末1.00 g，加入80%乙醇溶液50 mL，加热回流，过滤取上清液弃药渣，即得供试品溶液。

1.4 总黄酮含量的测定

参考向蓉[10]方法，利用NaNO2-AL(NO3)3-NaOH显色法进行总黄酮含量的测定。 精密量取1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL芦丁标准品溶液置于25 mL容量瓶中，各加30%乙醇至6.00 mL，加5%亚硝酸钠(50 mg/mL)溶液1.00 mL，混匀，放置6 min；再加10%硝酸铝溶液(100 mg/mL)1.00 mL，摇匀，放置6 min；加NaOH溶液(40 mg/mL)10.00 mL，再加30%乙醇至刻度，摇匀，放置15 min，以相应试剂为空白。 在510 nm波长下测量吸光度。以吸光度为纵坐标、芦丁标准液的浓度(mg/mL)为横坐标，绘制标准曲线，建立回归方程。

精密量取一定体积的供试品溶液,按上述显色法操作后测定吸光度，将所得值代入回归曲线方程,再按下列公式计算出所称取的牡荆样品中总黄酮含量。

式中，X，回归线方程所得值(mg/mL)；n，稀释倍数；v，样液总体积(mL)；V，测定取样体积(mL)；W，样品质量(mg)。

1.5 方法学考察

分别从精密度、稳定性、重复性和加样回收率对1.4已建立的方法进行方法学考察。①精密度试验：显色后的供试液连续测6次吸光度，计算总黄酮浓度。②稳定性试验：供试液分别于显色0、10、20、30、40、50、60 min测吸光度，计算总黄酮浓度。 ③重复性试验：制备6份供试液，测定6份供试液的吸光度，计算总黄酮的浓度，重复3次。 ④加样回收率试验：平行制备6份供试液，平均分成3组，各取5.0 mL(内含3 mg总黄酮)分别加入一定量的对照品，使加入量分别约为化合物原始含量的80%、100%和120%，测定其吸光度，计算加标回收率。

1.6 单因素试验

牡荆总黄酮提取的基本条件为：乙醇浓度60%、提取时间1.5 h、提取温度60 ℃、料液比1∶10。单因素试验条件：乙醇浓度分别设定为40%、50%、60%、70%、80%和90%；提取时间分别设定为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 h。提取温度分别设定为40、50、60、70、80和90 ℃；料液比分别设定为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30和1∶35。分别考察乙醇浓度、提取时间、提取温度和料液比对牡荆总黄酮提取量的影响。

1.7 正交试验设计

根据单因素试验结果，确定各因素的最优工艺水平，选择乙醇浓度(A)、提取温度(B)、提取时间(C)、料液比(D)作为考察因素，以牡荆总黄酮的提取量作为考察指标,进行L9(34)正交试验(表1)。

表1 正交试验因素水平

1.8 验证试验

按照最佳工艺条件下的乙醇浓度、提取温度、提取时间和料液比，进行重复试验验证。

1.9 抑菌试验

复苏纯化后的产气荚膜梭菌，挑取单菌落接种至FT培养基中，37 ℃厌氧培养5 h至对数生长期。采用灭菌空白培养基校正菌液浓度，使活菌数为1×106CFU/mL，制成菌悬液。

取96孔培养板，在96孔板每孔中加入100 μL FT液体培养基。在第1～7行(A～G)的第1列中，加入牡荆提取液100 μL，按2倍稀释原则逐级分别稀释至250、125、62.5、31.25、15.63、7.81和3.91 μg/mL。第1～6行(A～F)中，每孔加入100 μL菌悬液,第7行(G)为阴性对照组，第8行(H)为空白对照组。在37 ℃生化培养箱中厌氧孵育24 h，观察96孔板中有无菌落生长。考察在最佳工艺条件下提取的牡荆提取物对产气荚膜梭菌的最小抑菌浓度(MIC)。

2 结 果

2.1 标准曲线

以吸光度为纵坐标、芦丁标准液的浓度为横坐标绘制标准曲线(图1)，回归方程为：y=11.496x+0.0463，相关系数R2=0.998。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Stand curve of Rutin

2.2 方法学考察

依照方法学考察要求，分别进行精密度、稳定性、重复性及加样回收率考察。精密度试验RSD=0.177%，表明该仪器的精密度良好。稳定性试验在50 min时RSD=2%，说明供试品溶液在50 min内稳定。重复性试验的RSD=0.94%，符合要求，说明该方法的重复性良好。加样回收率分别为101.55%、102.56%、104.44%，RSD=1.42%。以上方法学考察结果均符合要求，表明牡荆总黄酮含量测定方法成立。

2.3 单因素试验

由图2A可知，随着乙醇浓度升高牡荆提取液总黄酮含量先升后降，乙醇浓度为60%时总黄酮含量最高(31.10 mg/g)。由图2B可知，随着提取温度升高牡荆提取液中总黄酮含量逐渐降低，提取温度为40 ℃时，总黄酮含量最高(30.69 mg/g)。 由图2C可知，随着提取时间延长牡荆提取液中总黄酮含量先降后升再降，提取时间为2.5 h时总黄酮含量最高(30.69 mg/g)。 由图2D可知，随着料液比的增加牡荆提取液总黄酮含量基本呈先升后降趋势，在料液比为1∶35时，总黄酮含量最高(44.35 mg/g)。

2.4 正交试验

由表2可知，最佳提取工艺条件组合为：A3B2C3D3，即乙醇浓度60%、提取温度50 ℃、提取时间2.5 h、料液比为1∶35，由RD>RC>RA>RB得其因素影响顺序为：料液比>提取时间>乙醇浓度>提取温度。

2.5 验证试验

按照最佳工艺条件进行重复试验验证，在最佳提取工艺条件下3次验证试验提取物总黄酮含量分别为46.23、45.28和46.16 mg/g，平均可达45.89 mg/g，RSD为1.15%，具有较好的重复性。

2.6 抑菌试验

牡荆提取物对产气荚膜梭菌的MIC检测结果见表3。由表3可知，牡荆提取物对产气荚膜梭菌具有较好的抑制效果，MIC值为7.81 μg/mL。

图2 乙醇浓度(A)、提取温度(B)、提取时间(C)和料液比(D)对牡荆提取液总黄酮含量的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration (A),extraction temperature (B),extraction time (C) and solid-liquid ratio (D) on total flavonoids content of V. negundo extract

表2 正交试验结果

表3 最小抑菌浓度测定结果

3 讨 论

黄酮类化合物是植物经光合作用产生的一大类低分子质量的天然物质[11],广泛存在于植物的根、茎、叶、花和果实中,且具有广谱抑菌性[12]，多种耐抗生素的细菌依然对其敏感，且该类化合物不易产生耐药性[13]。牡荆属植物中普遍存在黄酮类化合物,从该属植物中已获得的黄酮类化合物有黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、查耳酮、二氢查耳酮以及黄烷醇种结构类型共49个化合物,其中16个为黄酮苷类[14]。孙阿宁等[15]在牡荆素对葡聚糖硫酸钠所诱导的小鼠溃疡性结肠炎的药效试验中发现，牡荆素能有效减轻小鼠试验性溃疡性结肠炎,缓解炎症反应。 所以本试验以总黄酮提取量作为主要考察指标。

黄酮类化合物多为结晶性固体，少数为无定型粉末，不溶于水或难溶于水，易溶于有机溶剂[16]，目前最常用的有甲醇、乙醇、丙酮和乙酸乙酯[17]等有机溶剂,由于乙醇无毒性、价格低廉,所以本试验选择采用乙醇加热回流对牡荆进行提取工艺的优化。由正交结果及方差分析可知，乙醇加热回流提取牡荆总黄酮的最优工艺为乙醇浓度60%、提取时间2.5 h、提取温度50 ℃、料液比为1∶35，其因素影响顺序为料液比>提取时间>乙醇浓度>提取温度。验证试验结果表明，在最优提取工艺下，总黄酮提取量平均可达45.89 mg/g。代现平等[18]在山牡荆总黄酮提取工艺试验中发现，黄酮提取量平均为39.63 mg/g，本试验的牡荆总黄酮的提取量相对较高。黄琼[19]在牡荆挥发油和黄酮提取工艺试验中得出微波法的提取效果最好，微波法有节省提取时间和试剂、污染小的优点,但对设备有一定的要求,而且一次性提取的物料较少,不能进行大规模的提取。同时在微波法下考察不同部位总黄酮提取量中，叶的提取量最高，达93.30 mg/g，茎最低，为31.89 mg/g。本试验所用牡荆为地上部分，总黄酮提取量相对单独牡荆叶的提取量较低，但是因为牡荆地上部分产量大，采摘方便，乙醇加热回流也可以满足大量提取，所以本试验的提取方法更适用于实际生产中。本提取工艺不足之处在于乙醇用量相对较多，在实际生产中成本较高。

黄酮类化合物具有广泛抑菌性[20]，但是从应用的角度来看，MIC值<100 μg/mL的黄酮类化合物才具有一定的价值，MIC值<10 μg/mL的黄酮类化合物会引起人们更大的关注[21]。而产气荚膜梭菌作为一种多产毒素产生菌，是引起人和动物坏死性肠炎的主要病原体[22]，由其引起的鸡坏死性肠炎给全世界的家禽养殖业造成了巨大的经济损失，已成为家禽养殖中最重要的肠道疫病之一的病原体[23]。 在本试验中，最优提取工艺下的牡荆提取物对产气荚膜梭菌的MIC值为7.81 μg/mL。段凯文等[24]在中药及组方对产气荚膜梭菌体外抑菌试验中发现黄连的抗菌活性最强，MIC值为0.98 mg/mL,本试验中牡荆提取物的抑菌浓度相对更低。苏皓瑀等[25]在酸化剂及其衍生物与植物精油复合使用的体外抑菌试验中发现，复合精油对产气荚膜梭菌的MIC值为312.50 μg/mL，植物精油与单月桂酸甘油酯复合物对产气荚膜梭菌体外抑菌效果最好，MIC值为4.88 μg/mL。本试验的抑菌试验结果优于单独使用复方精油的试验结果，但不如酸化剂和植物精油复合物的抑菌试验结果。相较之下，牡荆提取物对产气荚膜梭菌的体外抑菌能力可观，有作为新型兽药或饲料添加剂进行开发的潜力。

4 结 论

牡荆在乙醇浓度60%、提取时间2.5 h、提取温度50 ℃、料液比为1∶35的提取工艺条件下总黄酮含量最高，可达45.89 mg/g，该条件下的牡荆提取物对产气荚膜梭菌的MIC值为7.81 μg/mL，有较好的抑菌效果。