加味平胃口服液提取工艺研究

陈昱骁，李焕娟，席晓花，郝 洁，周德刚，司红彬

(1.广西大学动物科学技术学院，亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，南宁 530004；2.洛阳惠中兽药有限公司，洛阳 471003)

鸡传染性腺胃炎是由多种因素混合感染所引起的一种具有传染性的综合征。该病在中国最早由王永坤等[1]于1996年在山东、江苏等地发现，目前在国内已成流行趋势，给养鸡业带来了严重的经济损失。加味平胃口服液是用于治疗家禽传染性腺胃炎等病症的复方口服液，其依据传统中兽医理论，结合现代中药药理研究，在经典方剂平胃散[2-3]的基础上加减而成，由苍术、厚朴、陈皮、木香、苦参、枳壳和甘草七味药组成。其功能为益气健脾，消食开胃，主治家禽采食及饮水减少、生长迟缓或停滞、饲料转化率低及饲料消化不充分等症状。

挥发油是中药发挥疗效的重要物质基础之一，但其提取工艺一直是限制含挥发油制剂质量的瓶颈问题。传统含挥发油的芳香性药物多以武火迅速煮沸，数分钟后，改用文火略煮，尽量避免久煎。现代挥发油的提取方法有水蒸气蒸馏法、溶剂法、压榨法和吸收法、微波法、超声法、超临界流体萃取法和亚临界水提取法等，其中水蒸气蒸馏法以水为溶剂，设备简单，易操作且成本较低，是目前制药企业普遍采用的通用方法。刘巧明等[4]通过正交试验考察清肺口服液的水提方法，结果最佳提取工艺为8倍水浸泡1 h,回流提取2次,每次1.5 h；乔红培等[5]采用L9(34)正交试验，分别对挥发油提取工艺和水提工艺进行优化，结果挥发油提取工艺为加6倍量的石油醚，浸泡12 h，超声震荡提取1 h；水提工艺为加10倍水煎煮，煎煮3次，每次1 h。本研究采用类似方法先将苍术、厚朴、陈皮、木香和枳壳五味药材进行挥发油提取，药渣混合剩余药材进行水煎煮提取。

临床试验表明加味平胃口服液效果显著、可靠。本研究采用正交试验等方法，确定加味平胃口服液科学合理、高效量产的提取工艺，以期为加味平胃口服液量产提供依据。

1 材料与方法

1.1 药材

苍术、厚朴、陈皮和枳壳均购自河南省修之合药业有限公司；木香购自河南省三禾药业有限公司；苦参购自甘肃惠森药业有限公司；甘草购自安徽聚草中药饮片股份有限公司；以上药材经鉴定符合《中华人民共和国兽药典》2020年版有关规定。苦参碱对照品、氧化苦参碱对照品和柚皮苷对照品均购自中国食品药品鉴定研究院。

1.2 主要试剂及仪器

乙腈购自Fisher公司；甲醇购自天津四友精细化学品有限公司；乙酸铵购自西陇科学股份有限公司；三氯甲烷购自烟台市双双化工有限公司。

U3000型高效液相色谱仪购自Thermo公司；1260型高效液相色谱仪购自安捷伦公司；Water，C18 5 μm，4.6 mm×250 mm型色谱柱购自XBridge®公司；100-5-C18，4.6 mm×250 mm型色谱柱购自Kromassil公司；DEKW-S-4型水浴锅购自北京永光明公司；KQ5200DA型超声清洗仪购自昆山市超声仪器有限公司；XSR205型和AB265-S型电子分析天平均购自梅特勒托利多公司；RV8旋转蒸发仪购自IKA公司；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵购自巩义予华仪器有限责任公司；DFT-100手提式粉碎机购自温岭市林大机械有限公司；DZTW调温电热套购自北京市永光明医疗器械有限公司。

1.3 挥发油提取工艺研究

1.3.1 饮片粒度处理 称取2/5个处方量的苍术、厚朴、陈皮、木香和枳壳，共4份，第1份饮片不处理直接投料，第2份饮片切成1～2 cm后投料，第3份饮片粉碎至全部通过12目筛后投料，第4份饮片粉碎过12目筛后用滤纸包埋之后投料。分别将上述饮片投料于三颈瓶中，加入10倍量水，连接挥发油提取器，待沸腾后开始计时，共蒸馏10 h，每1 h读取挥发油的量，绘制曲线图，比较不同饮片粒度挥发油提取量的差异[6-7]。

1.3.2 挥发油提取工艺正交试验 选定溶剂倍量(A)、浸泡时间(B)和煎煮时间(C)3个因素，每个因素各取3个水平，进行L9(34)正交试验，选用挥发油提取量作为评价指标，筛选最佳挥发油提取工艺条件[8-9]。主要因素水平见表1。

根据1.3.1试验结果，按处方比例称取1/5个处方量的苍术、厚朴、陈皮、木香和枳壳，置三颈瓶中，连接挥发油提取器，按照表1因素水平进行正交试验，提取结束后读取挥发油提取量[10]。

表1 挥发油提取工艺正交试验因素水平表

1.3.3 挥发油提取工艺验证试验 称取1/5个处方量的苍术、厚朴、陈皮、木香、枳壳饮片，平行3份，采用正交试验所优选的挥发油提取工艺进行验证试验，读取挥发油提取量[11]。

1.4 水煎煮提取工艺研究

1.4.1 水煎煮提取工艺正交试验 选定溶剂倍量(A)、煎煮时间(B)和提取次数(C)3个因素，每个因素各取3个水平，进行L9(34)正交试验[12]，选用柚皮苷含量和苦参总碱含量(苦参碱+氧化苦参碱总含量)作为评价指标，筛选最佳提取工艺条件[13]。主要因素水平见表2。

根据1.3.1试验结果，按处方比例称取1/5个处方量的苍术、厚朴、陈皮、木香和枳壳，置三颈瓶中，连接挥发油提取器，按照1.3.2确定的挥发油提取工艺提取挥发油，馏液8层纱布滤过，药渣合并1/5个处方量的苦参和甘草，按照表2因素水平进行正交试验，提取液8层纱布滤过，合并滤液及馏液，60～70 ℃减压浓缩至1 g/mL[14]。

表2 水煎煮提取工艺正交试验因素水平表

1.4.2 加味平胃口服液中柚皮苷含量测定

1.4.2.1 色谱条件 色谱柱：Water，XBridge®C18，4.6 mm×250 mm，5 μm；柱温为30 ℃，以乙腈-水(20∶80)为流动相，检测波长为283 nm，流速为1 mL/min。

1.4.2.2 对照品溶液的制备 取柚皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度为0.1 mg/mL的溶液，滤过，取续滤液。

1.4.2.3 供试品溶液及阴性对照溶液配制 取加味平胃口服液，精密移取2 mL，置100 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，静置，上清液滤过，取续滤液。另取缺枳壳的阴性对照同法制成阴性对照溶液。

1.4.2.4 测定 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液与阴性对照溶液各10 μL，注入液相色谱仪进行测定[15-16]。

1.4.3 加味平胃口服液中苦参总碱含量测定

1.4.3.1 色谱条件 色谱柱：Kromassil，100-5-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm；柱温为30 ℃，以乙腈-[0.01 mol/L乙酸铵溶液(浓氨试液调pH 8.1)](3∶2)为流动相 A，0.01 mol/L乙酸铵溶液(浓氨试液调pH 8.1)为流动相 B，按照表3程序进行梯度洗脱；检测波长为225 nm，流速为1 mL/min[17]。

表3 洗脱梯度表

1.4.3.2 对照品溶液的制备 取苦参碱对照品、氧化苦参碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度为苦参碱0.04 mg/mL、氧化苦参碱0.008 mg/mL的混合溶液，过滤，取续滤液。

1.4.3.3 供试品溶液及阴性对照溶液配制 取加味平胃口服液，精密移取5 mL，置分液漏斗中，加30 mL水和1 mL氨水，混匀，加三氯甲烷振摇提取2次，每次25 mL，合并三氯甲烷液，减压浓缩至干，残渣加甲醇适量使溶解，转移至50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，过滤，取续滤液。另取缺苦参的阴性对照同法制成阴性对照溶液。

1.4.3.4 测定 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液与阴性对照溶液各5 μL，注入液相色谱仪进行测定[16]。

1.4.4 水煎煮提取工艺验证试验 按处方比例称取1/5个处方量的饮片，平行3份，先按确定的挥发油提取工艺提取挥发油，馏液8层纱布滤过，药渣合并苦参、甘草，再采用正交试验所优选的水煎煮提取工艺进行验证试验，提取液8层纱布滤过，合并滤液及馏液，60～70 ℃减压浓缩并分别定容至1 g/mL，检测柚皮苷含量、苦参总碱含量[18]。

1.5 数据统计与分析

挥发油提取工艺筛选中以挥发油提取量为指标，通过正交设计助手Ⅱ进行分析，采用极差法进行最佳因素排序，并得出最优组合。

水煎煮提取工艺筛选中以柚皮苷含量和苦参总碱、含量为指标，设定加权系数分别为0.4和0.6，采用综合加权评分法，计算出各次试验的综合评分。具体评分方法：以柚皮苷含量最大的一次试验判为100分，按照每次试验柚皮苷含量与最大柚皮苷含量的比例，计算各自柚皮苷含量指标中的得分。 同法，计算每次试验的苦参总碱含量得分。最后按照两项指标的加权系数，计算出各次试验的综合评分[19]。

综合评分=(柚皮苷含量/柚皮苷最大含量)×100×0.4+(苦参总碱含量/苦参总碱最大含量)×100×0.6

根据综合评分结果，通过正交设计助手Ⅱ进行分析，采用极差法进行最佳因素排序，并得出最优组合。

2 结 果

2.1 挥发油提取工艺

2.1.1 饮片粒度对挥发油量的影响 从挥发油量来看，饮片粉碎后的提取效果最好，1～2 cm的饮片次之，饮片不处理和饮片粉碎后包埋的效果最差(图1)。综合成本、对环境的影响及实际操作等因素选择1～2 cm的饮片更为合理。从每小时挥发油量的变化趋势来看，挥发油在提取9 h后趋势变缓，可将正交试验中煎煮时间最长定为10 h。

图1 挥发油提取量曲线图Fig.1 Volatile oil extraction volume curve

2.1.2 挥发油提取工艺正交试验结果 正交试验结果见表4，方差分析结果见表5。极差直观分析结果表明，影响挥发油提取因素大小为C>B>A,即煎煮时间(C)>浸泡时间(B)>溶剂倍量(A)。经方差分析，煎煮时间对提取效果有极显著影响(P<0.01)；而浸泡时间和溶剂倍量对提取效果影响较小，各水平间差异不显著。

综合分析以上结论，影响提取效果的因素顺序为：C>B>A，且C3>C2>C1，A1=A3>A2，B1>B2=B1，所以优选出来的工艺为A1B1C3，即8倍水，不浸泡，煎煮10 h。

表4 挥发油提取正交试验及直观分析结果

表5 挥发油正交试验方差分析结果

2.1.3 挥发油提取工艺验证试验结果 3份1/5处方量的药材挥发油提取量结果分别为1.2、1.2和1.3 mL，说明挥发油提取工艺稳定。

2.2 水煎煮提取工艺

2.2.1 水煎煮提取工艺正交试验结果 正交试验结果见表6，方差分析结果见表7。根据以上结果可知，在所选因素水平范围内，提取次数(C)>煎煮时间(B)>溶剂倍量(A)，其中提取次数对柚皮苷含量和苦参总碱含量有显著影响(P<0.05)，且C3>C2>C1；溶剂倍量和煎煮时间对其无显著影响(P>0.05)。综合考虑，优选提取工艺为A2B2C3。确定水煎煮工艺为8倍水，煎煮1.5 h，提取3次。

2.2.2 水煎煮提取工艺验证试验结果 由表8可知，柚皮苷含量分别为3.61、3.59和3.63 mg/mL，RSD为0.6%，苦参总碱含量分别为1.23、1.21和1.25 mg/mL，RSD为1.7%，表明该工艺稳定，可行。

表6 水煎煮正交试验结果及直观分析结果

表7 水煎煮正交试验方差分析结果

表8 水煎煮提取工艺验证试验结果

3 讨 论

中药提取的目的是将药材活性成分从中药材中最大限度地分离，从而达到有效成分与杂质非活性成分的分离[20]。现代研究表明，挥发油具有抗炎、抗病毒、解热镇痛等作用，是中药发挥疗效的重要物质之一[21]。药材粉碎粒度对于挥发油的提取有较大影响，本研究中饮片粉碎后的提取效果最好，1～2 cm的饮片次之，饮片不处理和饮片粉碎后包埋的效果最差，由于药材粉碎能耗较高，易产生粉尘与噪声，且煎煮过程易粘壁糊锅，既耗时耗力，又污染环境；1～2 cm的饮片最后提取总量和饮片粉碎后的相差不大，且1～2 cm的饮片相对来说更易处理；故选择1～2 cm的饮片更为合理。李志平[22]在对枳壳、木香混合药材挥发油提取工艺的研究时对药材的粉碎粒度研究中将药材粉碎成8、10、12、20和24目，结果在药材粒度10～12目时，挥发油提取率为最佳。与本研究结果相似，粗粉提取效果最好，药材粉碎太细或太粗都不利于挥发油提取。本研究利用水蒸气蒸馏法提取挥发油方法简单易操作，文献报道挥发油一般提取时间为7～10 h[23-25]，结合本试验挥发油提取正交试验结果，煎煮时间对提取效果有极显著影响，因此确定挥发油提取时间为10 h。

挥发油提取工艺正交试验结果表明，影响挥发油提取因素最大的为煎煮时间，对提取效果有极显著影响；而浸泡时间和溶剂倍量对提取效果影响较小，各水平间差异不显著，验证试验所制得的挥发油相对稳定，工艺过程可控性强、重复性较好。庞春燕等[26]在不同煎煮条件对加味银翘方煎出率的影响的研究中考察溶剂倍量、浸泡时间和煎煮时间3个因素，同样是煎煮时间对提取率影响最大。

水煎煮提取工艺正交试验结果表明，在对溶剂倍量、煎煮时间和提取次数3个因素考察中，提取次数>煎煮时间>溶剂倍量。李萍等[27]在正交试验法优选参芪益气口服液提取工艺研究中，选定3因素相同的情况下，确定影响因素主次为提取次数>提取时间>加水量，与本研究结果一致，说明提取次数对水煎煮工艺影响最大。加味平胃口服液中可将药材分为两部分，一部分为苍术、厚朴、陈皮、木香、枳壳含有挥发油成分的药材，另一部分为苦参、甘草不含有挥发油成分的药材。水煎煮正交试验中的考察指标，从含有挥发油成分的药材中选取枳壳中柚皮苷含量作为考察指标，从不含有挥发油成分的药材中选取苦参中的苦参碱和氧化苦参碱总含量作为考察指标。因枳壳经过挥发油提取时经过了一定时间的煎煮，其中部分有效成分已被提取出来，所以将柚皮苷的权重系数设置为0.4，苦参碱和氧化苦参碱总含量的权重系数设置为0.6[28-29]。采用综合加权评分法，计算出各次试验的综合评分。赵增成等[19]对银连解毒口服液的提取工艺研究中同样采用了加权评分的方法。本研究工厂化生产时，挥发油提取时间过久，耗能大等问题后续需结合工厂设备进一步研究。

4 结 论

本研究通过对提取方法、提取流程的试验验证，明确了加味平胃口服液的提取工艺为苍术、厚朴、陈皮、木香、枳壳五味药材切成1～2 cm大小，8倍水，水蒸气蒸馏10 h提取挥发油，收集挥发油和馏液备用，药渣加苦参、甘草，8倍水，煎煮1.5 h，提取3次，滤过，合并馏液及滤液，60～70 ℃减压浓缩至1 g/mL。该工艺稳定、高效、易操作，为加味平胃口服液的规模化生产提供了工艺参考和技术借鉴。