口腔鳞状细胞癌中MYLK3的表达及其临床病理意义

冯丽媛 高 峰 胡 洁 曾 婧 白 杨 王大维

肌球蛋白轻链激酶3（myosin light chain kinase 3，MYLK3）是肌球蛋白轻链激酶家族的一员，由Seguchi O 等[1]于2007 年发现，其对于心脏收缩和肌节组织的形成至关重要。前列腺、睾丸、肾、肺等多种正常组织中，均发现有MYLK3 低水平的表达，但最近的临床研究及实验结果发现在其在卵巢癌、肝癌及乳腺癌中存在异常表达[2，3，4]。目前国内外尚未见针对MYLK3 在口腔鳞状细胞癌中具体表达情况的相关报导。本研究采用免疫组织化学ABC 法观察和检测其在OSCC 和正常口腔粘膜中的表达情况，分析其与临床病理指标之间是否存在相关性，并初步探讨及阐述其临床病理意义。

资料和方法

1.临床资料：在取得伦理委员会批准后自本院病理科选取1991 年到2020 年间密封保存的蜡块，其中正常口腔粘膜上皮30 例，OSCC 65 例（包括舌癌20 例、颊癌18 例、牙龈癌27 例），年龄24～80 岁成年患者，男34 例，女31 例，无淋巴结转移10 例，55 例有淋巴结转移；15 例低分化，50 例中高分化（根据世界卫生组织分类标准，分化程度被分为高分化、中分化、低分化和未分化，为统计方便将高分化和中分化合并为中高分化，低分化和未分化合并为低分化）。入选实验标准：①肿瘤原发于舌部、颊部或牙龈；②术前经2 名副高及以上职称的病理专家病理诊断为鳞状细胞癌；③术前未行放、化疗等其他辅助治疗。

2.试剂与实验方法：间隔5 μm 对石蜡包埋的组织进行连续切片，常规HE 染色和免疫组织化学ABC 染色。福建迈新生物试剂有限公司购买免疫组化检测试剂盒，兔抗人MYLK3 多克隆抗体试剂。免疫组织化学法染色步骤：组织切片进行脱蜡水化，3% H2O2甲醇对内源性过氧化物酶进行灭活，之后依次在切片中滴加一抗、二抗、三抗试剂，待DAB 显色后用苏木精试剂进行复染，常规方法进行脱水、透明、封片。用PBS 代替一抗作为空白对照。

3.染色结果判断：由两名计数者双盲进行阅片。每张切片随机选取5 个视野，每个视野计数100 个细胞，根据染色程度和阳性细胞所占比例综合评分。无黄染为0 分，轻度黄染1 分，中度黄染2 分，重度黄染3 分；阳性细胞＜5%为0 分，5%～25%为1 分，25%～75%为2 分，≥75%为3 分。0～1 分记为阴性，2～3 分记为阳性。

4.统计学分析：应用SPSS 26.0 版本统计软件进行统计学处理，正常粘膜与OSCC 之间、不同临床病例特征组之间MYLK3 的差异表达采用χ2检验，P＜0.05 为差异有显著意义。

结 果

1.MYLK3 在正常口腔粘膜及OSCC 中的表达情况：MYLK3 在高分化口腔鳞状细胞癌及低分化口腔鳞状细胞癌中的表达明显高于正常口腔粘膜组织（图1～3）。口腔鳞状细胞癌组和正常口腔粘膜组中阳性表达率比较差异有显著性（P＜0.05，表1）。

图1 MYLK3 在正常口腔粘膜中的表达（ABC ×200）

表1 MYLK3 在正常口腔粘膜和口腔鳞状细胞癌中的表达

图2 MYLK3 在高分化口腔鳞状细胞癌中的表达（ABC ×200）

图3 MYLK3 在低分化口腔鳞状细胞癌中的表达（ABC ×200）

2.MYLK3 表达与临床病理特征的关系：淋巴结转移组中MYLK3 的阳性表达率为80%，无淋巴结转移组的MYLK3 阳性表达率为27%，二者相比较有显著差异（P＜0.05）；低分化组中MYLK3 阳性表达率67%，高分化组阳性表达率26%，二者相比有显著差异（P＜0.05）。MYLK3 在OSCC 中的表达情况与患者肿瘤大小、部位以及患者的年龄、性别等无相关性（P＞0.05，表2）。

表2 MYLK3 表达与口腔鳞状细胞癌患者临床病理特征的关系

讨 论

MYLK3 基因是一种蛋白编码基因，位于16 号染色体（16q11.2），其在免疫应答信号传导和肌动蛋白细胞骨架的形成中具有重要作用[2]。MYLK3 表达上调时，可以促使心脏收缩增强及肌节形成，下调或缺失时可导致心脏收缩减弱及肌节瓦解破坏，明显的肌节失调可促使心肌细胞衰竭[5]，继而通过多种方式诱导心力衰竭的发生[6，7]，有相关研究显示MYLK3 基因的突变还与家族性扩张型心肌病之间存在明显的关系[8，9]。除此之外，MYLK3 可能是败血症发生、发展的关键基因，通过多种方式参与了败血症的发病机制[10]。目前研究还发现，卵巢癌中MYLK3甲基化程度与患者预后呈正相关，MYLK3 基因的甲基化与病人的生存率相关，伴有MYLK3 甲基化率高的患者通过彻底的手术治疗有较好的预后，而甲基化率较低的患者经过前期彻底的手术治疗后预后较差[2]；通过抑制MYLK3 高表达可促进肝癌细胞的凋亡[3]；MYLK3 基因的缺失对于乳腺癌细胞的迁移起到促进的作用[4]；Chen.L 等发现MYLK 基因从正常病人组到癌前病变组再到胃癌组甲基化率逐渐提高[11]。以上讨论表明，MYLK3 在不同类型肿瘤的发生发展中起重要作用，并与部分肿瘤预后相关。

王娟等研究发现在口腔白斑中MYLK3 表达上升，推测其可能参与口腔白斑的发生[12]，而口腔白斑属癌前病变[13]，大约4%的口腔白斑可在吸烟，饮酒等多种因素的促进作用下发展为OSCC，其转变为OSCC 的风险比正常人平均高出近100 倍[14]，因而我们推断，MYLK3 可能参与了OSCC 的发生发展。本研究发现OSCC 中MYLK3 的表达较正常口腔粘膜增加，二者阳性表达率差异有显著性（P＜0.05），进一步提示MYLK3 在OSCC 的发生发展中具有重要作用。目前可知，口腔鳞癌组织中粘着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）表达显著增强，其参与细胞增殖、迁移及凋亡的调控[12]，Horton ER 等[15]发现FA（focal adhesion，FA）中有粘着斑激酶的特定位点。FAK 可介导细胞外基质整合素参与下游的信号传导[16]，从而在细胞的迁移、增殖[17]、上皮间充质转化（epithelial- mesenchymal transition，EMT）[18]以及血管生成[19]等过程中发挥不可或缺的作用。研究表明，肺癌[20]、肝癌[21]、胸腺癌[22]、结直肠癌[23]等恶性肿瘤以及口腔白斑[24]中普遍存在FAK 的异常表达。MYLK3是粘着斑信号通路的重要组成部分，两者于白斑组织中的表达同时增高[12]，由此推断，MYLK3 高表达使肌动蛋白细胞骨架异常，通过某些方式可能影响粘着斑内部结构，致使FAK 无相应附着位点，对下游信号传导产生一定的影响，从而改变对细胞生长、细胞周期以及细胞凋亡的调控，使肿瘤细胞无限增生，继而促使肿瘤的发生、发展。但MYLK3 通过何种机制影响FAK 的表达及功能，进而促进肿瘤的发生发展，有待于我们以后的研究。

Souza-Smith FM 等[25]研究发现，MYLK3 可使肌球蛋白轻链（myosin light chain，MLC）发生磷酸化，磷酸化后会导致淋巴管系统平滑肌的收缩，其收缩是通过肌动蛋白肌球蛋白介导的。本研究发现MYLK3 的表达与淋巴结转移呈正相关，二者相比，有显著差异（P＜0.05），这一结果提示MYLK3 可以作为一个新的预测淋巴结转移的生物学标志物，为肿瘤转移以及判断预后提供依据。由此推测，肿瘤中MYLK3 的异常表达与淋巴收缩异常或许有着一定的关系，以此来提高淋巴结转移率，但其具体机制还需要进一步探讨。

本研究亦显示低分化组的阳性表达率（67%）明显高于高分化组的阳性表达率（26%），二者相比，有显著差异（P＜0.05），这一结果提示，MYLK3 表达随着OSCC 恶性程度的增加而增加，加之 MYLK3 与肿瘤的转移有关，可以认为MYLK3 阳性表达的患者，其肿瘤更具有转移的可能性。

总之，MYLK3 在OSCC 中的表达较正常口腔粘膜中的表达有明显增加。其在OSCC 的发生、发展、分化及转移过程中具有非常重要的作用，推测其可以作为一个用于预测OSCC 淋巴结转移的生物学标志物，MYLK3 阳性表达者发生淋巴结转移可能性更大。本研究的目的也在于为OSCC 的治疗和分子靶向治疗提供新的研究思路。