雷帕霉素诱导自噬对牙髓干细胞体外增殖的影响及其机制研究

何 飞 罗 文 温超颖 何 飞

牙髓是高度矿化结构的牙齿中唯一的软组织， 具有形成、营养、感觉和防御四大重要功能[1]。牙髓受到各种环境刺激物造成的创伤和感染时，由于牙齿特殊的解剖结构和牙髓组织有限的自我修复能力，很容易导致不可逆的牙髓炎或坏死，最终使牙齿组织断绝大部分的营养来源。牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs）是存在于牙髓组织中的一类神经嵴来源的间充质干细胞，具有神经生成、血管生成和神经血管诱导等多向分化潜力，在再生医学和牙组织工程中显示出广阔的应用前景[2]。

自噬是正常细胞内的物质降解途径之一，又称为Ⅱ型程序性细胞死亡（type II programed cell death），以胞质内出现双层膜结构包裹长寿命蛋白和细胞器的自噬体为特征。自噬广泛存在于真核细胞中，在包括干细胞在内的正常细胞生长发育和生理病理过程中发挥着极其重要的作用[3]。对于成体干细胞，自噬一方面与其干性的维持关系密切[4]，另一方面，自噬的稳态对于多种干细胞的增殖和分化至关重要。既往研究发现，自噬抑制剂可阻断DPSCs迁移，而自噬激活剂雷帕霉素（rapamycin，RAPA）预处理则可提升DPSCs 迁移水平[5]。我们前期研究表明：DPSCs 体外增殖与Notch 信号激活及自噬抑制有关[6]。本研究拟以研究常用的自噬诱导剂RAPA制作体外DPSCs 自噬诱导模型，进一步探讨自噬对hDPSCs 增殖的影响及作用机制，为揭示hDPSCs 的调控机制及其临床应用提供理论依据。

资料和方法

1.细胞来源、主要仪器：hDPSCs（广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司，P3 代）；细胞培养箱（ESCO，LA2-4A1-E）；生物安全柜（上海力申，HFsafe-15）；全自动倒置荧光显微镜（莱卡，DMi8）；台式低速离心机（安徽中科中佳，SC-3610）；分析型流式细胞仪（Beckman Coulter，DxFLEX）；多功能酶标仪（Tecan，Spark 10M）。

2.hDPSCs 培养：本研究采用的hDPSCs 培养体系 为IMDM 培 养 基（GIBCO 公 司），10% FBS（GIBCO 公司），青链霉素（1×105U/L）；培养条件为37℃，5% CO2，100%相对湿度。本研究检测使用第5～6 代hDPSCs。

3.细胞表面标记蛋白检测：将传代培养24h 的hDPSCs 用0.25%胰酶消化离心重悬，得到单细胞悬液。用间充质干细胞阳性表面标志蛋白CD29，CD44，CD73，CD90，CD105（BD 公司，浓度1：200），CD166（Biolegend 公司，浓度1：200）和阴性标志蛋白CD34，CD45（BD 公司，浓度1：200）的抗体避光孵育细胞，然后用分析型流式细胞仪检测各个标志蛋白的表达比例。

4.细胞增殖测定（CCK-8 法）：取对数生长期的hDPSCs 种植于96 孔板，每孔5×103个细胞，200 μL完全培养基，实验处理组分别加入终浓度1 nM，2 nM，5 nM，10 nM，20 nM RAPA（MCE 公司），以未给药组为对照组，每组6 个重复孔，培养0~4 d。每隔24 h 检测一批样品，每孔加入含5% CCK-8的基础培养基100 μL，37℃孵育1 h，酶标仪检测450 nm 波长的吸光值。

5.细胞周期测定：将不同浓度（1 nM，2 nM，5 nM，10 nM，20 nM）RAPA 处理24h 后的hDPSCs 用0.25%胰酶消化成单细胞悬液。4℃预冷的70%乙醇固定细胞30 min。碘化丙啶染色液（碧云天）37℃避光温浴细胞30 min。流式细胞仪分析各个细胞周期时相的细胞比例，激发波长为488 nm，接收波长610 nm。联机专用软件进行结果分析。

6.蛋白质免疫印迹检测：细胞裂解液处理hDPSCs，提取总蛋白。考马斯亮蓝法进行蛋白质样品定量。蛋白电泳时每次每样30 μg 等量上样。经转膜、一抗孵育，4℃过夜；回收一抗孵育液，TBST 漂洗3 次，每次10 min，加入配好的二抗孵育液室温摇床1 h，TBST 洗膜3 次，ECL 显影液显影，在显影仪下扫描蛋白条带。所用抗体：β-Actin 小鼠单抗（全式金生物，1:2000），GAPDH（全式金生物，1:2000），CDK4（CST，1:1000），CDK6（CST，1:1000），CyclinD1（CST，1:1000），SQSTM1/p62（CST，1:1000），Atg5（CST，1:1000），LC3A（CST，1:1000），PCNA（CST，1:1000），二抗（羊抗兔HRP 交联的二抗和羊抗鼠HRP 交联的二抗，GeneStar 公司，浓度1:4000）。

7.GFP-LC3 融合蛋白示踪实验：在载体质粒AAVS1 GCaMP6f 的克隆位点：SalI/MluI 进行酶切，连接合成的GFP-LC3 基因序列，构建GFP-LC3 融合蛋白质粒。将该质粒转染hDPSCs，得到可以示踪LC3 的hDPSCs 细胞系。将对照组和RAPA 处理组细胞用PBS 清洗2 遍，4%多聚甲醛室温固定20 min。PBS 清洗2 遍，倒置荧光显微镜下观察，拍照，根据GFP 的荧光强度评估不同处理组细胞的LC3 蛋白表达量。

8.统计学分析：采用Graphpad Prism 6 软件进行数据分析。多组定量数据之间的比较使用单因素方差分析。RAPA 高浓度组（5 nM，10 nM，20 nM）与低浓度组（1 nM，2 nM）之间的比较为t检验。P值小于0.05 即表明差异具有统计学意义。

结 果

1.hDPSCs 细胞形态：体外hDPSCs 贴壁生长，呈梭形或多角形。待细胞长密，铺满培养皿时，底层细胞-细胞间紧密连接，连成片；上层细胞处于分裂期，呈圆形（图1）。

图1 倒置显微镜下hDPSCs 形态（ ×100）

2.hDPSCs 表面标志：hDPSCs 属于组织来源的间充质干细胞，表达部分间充质干细胞共有的表面标记蛋白。流式结果显示，hDPSCs 中表达的CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166 的阳性细胞百分比分别为96.7%、98.7%、99.5%、97.8%、96.1%，99.1%，均大于95%。而间充质干细胞阴性标记蛋白CD34 和CD45 的百分比分别为1.2%、1.6%，均小于2%（图2）。

图2 流式细胞仪检测hDPSCs 表面标记蛋白

3.RAPA 诱导对hDPSCs 细胞自噬相关蛋白表达的影响：RAPA 是常用的细胞自噬诱导剂。细胞免疫荧光结果显示，RAPA 处理组细胞的GFP-LC3 绿色荧光显著多于对照组（图3）。以不同浓度的RAPA 处理模拟不同程度的细胞自噬。蛋白质免疫印迹结果显示，与对照组相比，随RAPA 浓度升高，自噬相关蛋白ATG5、P62、LC3II/I 表达量逐渐增加（图4），作用呈剂量依赖性。以上结果提示RAPA 成功诱导了hDPSCs 细胞自噬。

图3 RAPA 诱导自噬对hDPSCs LC3II 的影响（ ×200）

图4 hDPSCs 细胞中自噬相关蛋白Atg5、p62 及LC3 的表达***P＜0.001

4.RAPA 诱导自噬对hDPSCs 细胞增殖影响：不同浓度RAPA 诱导的自噬均能降低hDPSCs 的增殖能力。CCK-8 细胞增殖实验结果显示，RAPA 诱导1天，hDPSCs 的增殖较对照组显著降低，随着诱导时间延长，实验组与对照组的差异更加显著。诱导第4天时，高浓度组（5 nM、10 nM 和20 nM）较低浓度组（1 nM 和2 nM）的细胞增殖抑制作用更显著（P＜0.05）（图5）。

图5 不同浓度RAPA 诱导自噬可抑制hDPSCs 的增殖*P＜0.05；***P＜0.001

5.RAPA 诱导自噬对hDPSCs 细胞周期影响：为探讨自噬抑制hDPSCs 增殖影响是否与细胞周期有关，我们利用流式细胞仪测定不同浓度RAPA 诱导自噬后，hDPSCs 的细胞周期变化情况，各个细胞周期时相的结果见表1。实验组和对照组hDPSCs 细胞周期各时相中G0/G1 比例均最高，正常对照组为63.5%，细胞增殖指数（proliferation index，PI，S+G2/M）为36.5%。RAPA 诱导组hDPSCs 的G0/G1 比例随药物浓度增加而上调，而对应的G2/M 和S 的细胞比例随药物浓度下调。由此可见，RAPA 诱导的细胞自噬引起hDPSCs 细胞周期的改变。

表1 不同浓度RAPA 处理后hDPSCs 的细胞周期时相的变化（%）

6.RAPA 诱导自噬对hDPSCs 细胞周期和增殖相关蛋白表达的影响：为探讨RAPA 诱导自噬抑制hDPSCs 细胞增殖的机制，我们检测了细胞周期和细胞增殖相关蛋白的表达水平。结果显示，与对照组相比，实验组的细胞周期相关蛋白Cyclin D1、CDK4和CDK6 表达下调，同时细胞增殖相关分子PCNA蛋白表达水平较对照组显著下调（图6）。

图6 自噬对细胞周期蛋白和增殖相关蛋白的作用**P＜0.01；***P＜0.001

讨 论

DPSCs 是一种神经嵴来源的间充质干细胞，2000 年被首次从成熟牙髓组织中分离并命名[7]。与其他间充质干细胞一样，DPSCs 通常位于具有丰富神经末梢的血管周围微环境中，有助于维持组织的平衡，参与组织修复。牙髓组织受到损伤、炎症等刺激会向损伤部位迁移、增殖并分化为成牙本质细胞，分泌牙本质基质，参与修复性牙本质形成过程，在牙髓-牙本质损伤修复中发挥重要作用，是临床包括盖髓术、部分牙髓切断术等活髓保存治疗的细胞学基础[8]。另外，它也是牙髓组织再生的重要种子细胞来源。DPSCs 具有容易获得，体外高度增殖活性及多向分化能力等的优点，已有大量应用DPSCs 进行组织工程化牙髓-牙本质再生的相关研究[9]。

DPSCs 的特性之一是强增殖活性，是其临床应用的重要基本属性。DPSCs 在体内常受到感染、低氧等可诱导细胞自噬环境的影响。自噬作为一种强有力的质量控制机制，影响干细胞的增殖、分化及干性维持，在干细胞内环境稳定中起着关键作用[10]。因此，探讨体外培养条件下自噬对DPSCs 增殖的影响具有重要意义。

TOR（target of rapamycin）是一个调控细胞周期、生长和增殖的丝氨酸/苏氨酸激酶。在哺乳动物中TOR 的同源物mTOR （mammalian target of rapamycin）处于活化状态，磷酸化抑制自噬起始分子ULK1 的功能，抑制自噬的发生[11]。RAPA 作为mTOR 活性抑制剂，成为常用的细胞自噬诱导剂。本研究利用RAPA 处理牙髓干细胞，成功诱导出细胞自噬模型：GFP-LC3 融合蛋白示踪实验发现，RAPA处理组细胞的LC3 绿色荧光显著多于对照组；RAPA 处理组自噬相关蛋白ATG5、P62、LC3II/I 表达量增加，作用呈药物浓度依赖性。

自噬对牙源性干细胞增殖的影响随细胞种类、自噬诱导原因、细胞微环境等的不同而不同。本研究使用的1～20nM 浓度的RAPA 均能降低hDPSCs的增殖能力，且随着药物作用时间延长，增殖抑制作用更加显著。有研究发现，DPSCs 受IL-37 刺激能诱导自噬增强，但对细胞增殖活性无明显影响[12]；Rémy M 等研究发现，低氧条件下根尖牙乳头干细胞（stem cells from apical papilla，SCAP）细胞自噬活性提高，体外增殖能力增强[13]；另外研究则发现，炎症条件下SCAP 细胞自噬活性提高，但体外增殖能力下降[14]。因此，自噬与牙源性干细胞增殖的关系受多种因素调控，深入探讨自噬对牙源性干细胞增殖的影响及其机制是牙源性干细胞研究及临床应用的重要方面。

细胞周期时相改变与细胞增殖能力紧密相关。本研究发现DPSCs 细胞自噬增强降低了细胞增殖指数，改变了细胞周期时相的比例：体外培养hDPSCs 细胞周期以G0/G1 期为主，符合其作为干细胞的特性。而自噬诱导更进一步提高了细胞G0/G1期比例（＞80%）。其作用可能通过调控细胞周期相关蛋白CDK4、CDK6 及Cyclin D1 表达水平实现。cyclin D1、CDK4 和cyclin-CDK6 复合体通过Rb 磷酸化驱动细胞周期通过G1-S 过渡，控制细胞周期G1-S 转变[15]。自噬使DPSCs 的CDK4、CDK6 及Cyclin D1 表达下调，抑制了细胞周期G1-S 转变，提高了细胞G0/G1 期比例。PCNA 是一种分子量为36KD 的蛋白质，在细胞核内合成，并存在于细胞核内，PCNA 在G0/G1 期细胞中无明显表达[16]。本研究发现在自噬的DPSCs 细胞群中，G0/G1 期细胞比例升高，PCNA 蛋白水平降低。

RAPA 作为mTOR 活性抑制剂，其作用机制也可能与mTOR 信号通路有关[17]。mTORC1 是许多上游刺激和信号的焦点，包括MEK/ERK 和PI3K/Akt/mTOR 信号通路，它们可调节自噬等细胞活动。ERK是丝裂原激活蛋白激酶家族的成员，对细胞内和细胞外刺激都有反应。p-ERK 调节细胞骨架蛋白、激酶和转录因子，可致细胞基因表达、细胞增殖和分化的改变。MEK/ERK 的激活和mTORC1 的抑制可以增强自噬相关蛋白的表达，导致自噬活性增加[18]。RAPA 诱导的自噬对DPSCs 增殖抑制作用与mTOR信号通路关系将成为我们下一步研究的重点。

综上，本研究发现，RAPA 诱导的细胞自噬可显著抑制hDPSCs 的体外增殖，其作用与细胞周期改变和细胞增殖相关蛋白表达水平下调有关。通常RAPA 降低干细胞增殖和生长被认为可以防止干细胞衰竭，从而保持其干性。因此，RAPA 作为干细胞调控工具之一，对DPSCs 相关的基础研究及未来的临床应用具有重要价值。