NF-κB信号通路在硬骨鱼免疫中的作用研究进展

刘 念，周俊豪，杨 映

( 佛山科学技术学院 生命科学与工程学院，广东 佛山 528225 )

核转录因子κB(NF-κB)信号通路的激活对于机体的免疫应答、细胞凋亡及应激反应等应答过程至关重要。通过多年的研究，已对鱼类NF-κB通路的调节作用有了一些认识。在硬骨鱼中NF-κB转录因子是多种靶基因的关键调控因子，这些靶基因包括免疫调节基因和生长控制基因、细胞存活基因和细胞死亡基因，它可以被多种刺激激活，从而调控多种免疫应答相关分子的表达。在硬骨鱼中涉及NF-κB信号通路调控机制的研究还比较零散，笔者从硬骨鱼类NF-κB信号通路调控机制、免疫应答、调控凋亡几方面进行综述，探讨NF-κB信号通路在硬骨鱼免疫中的调控网络及转导途径。重要的是通过有关该通路的机制研究，可以为人工干预NF-κB通路增强鱼类的抗病能力提供理论基础。

1 NF-κB信号通路调控机制

1.1 NF-κB的激活

首次发现NF-κB时，其被证明可以与B细胞免疫球蛋白基因转录控制元件中的保守特征序列结合[1]。经过大量的研究后发现，几乎在所有细胞类型中均可诱导NF-κB活性，现在已知NF-κB/Rel家族的成员可调节许多涉及免疫和炎症反应的基因[2]。NF-κB家族成员包括NF-κB1(蛋白产物为p50及其前体p105)、 NF-κB2(p52及其前体p100)、REL(c-Rel)、RELA(p65或RelA)、RELB(Rel B)，通过同源或异源结合成二聚体与抑制性蛋白IκB相互作用形成复合物保留在细胞质中[3-4]。研究表明，NF-κB作为一种转录因子从昆虫到哺乳动物都是保守的[5-7]，Correa等[8]也发现，斑马鱼(Daniorerio)的NF-κΒ蛋白能够结合哺乳动物的共有DNA结合(κB)位点和抑制性蛋白IκBα，这说明脊椎动物中NF-κB/IκB蛋白有保守性和相容性。NF-κB可被内毒素，炎性细胞因子如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)或白介素-1(IL-1)，病毒感染或某些病毒基因产物的表达，紫外线照射，B或T细胞激活，以及其他生理和非生理刺激而激活[9]。NF-κB的激活通过此过程完成，IκB激酶复合物(IKK)磷酸化细胞质中NF-κB复合体中IκB的两个丝氨酸，磷酸化的IκB随后被泛素标记并使其脱离复合体，而被泛素标记的IκB由酶水解，最终NF-κB二聚体暴露并进入细胞核结合相关基因元件调控广泛的基因表达[10-11]。研究表明，NF-κB参与许多生物反应，如其激活可以促进炎症反应，调控细胞凋亡，参与免疫应答等[12-15]。

1.2 NF-κB信号通路的信号传导途径

NF-κB激活途径包括经典和替代(非经典)途径。经典途径是通过Rel A与p50的二聚复合物激活的，而替代途径是由肿瘤坏死因子家族(不包括肿瘤坏死因子-α)如分化簇40配体(CD40L)、B细胞活化因子受体、淋巴毒素β受体诱导生成Rel B与p52的二聚复合物激活。经典途径是在多种刺激信号下诱导泛素—蛋白酶体系统将NF-κB复合物中IκB组分降解，释放的NF-κB二聚体可以进入细胞核，与靶基因κB位点结合并调节基因表达。在经典途径中，NF-κB二聚体与IκB家族抑制性分子相互作用并形成一种稳定复合物(图1)。NF-κB信号转导通路被促炎性细胞因子受体激活，例如肿瘤坏死因子受体，白介素-1受体和Toll样受体家族成员TLR3、TLR4、TLR7；抗原受体，如T细胞受体和B细胞受体。这些受体能够激活IKK(包括IKKα，IKKβ和IKKγ)，磷酸化IκB并促进其泛素化，最终被26S蛋白酶体降解，降解后的二聚体进入细胞核内发挥转录调控作用。在替代(非经典)途径中，没有IκB，但是RelB/p100复合物在细胞质中无活性。分化簇40配体，淋巴毒素β受体和B细胞活化因子受体发出的信号导致NF-κB诱导激酶(NIK)活化，使同型二聚体IKKα/IKKα磷酸化，p100的C端残基上的磷酸基团被泛素化并被蛋白酶处理成p52。RelB/p100复合物最终形成RelB/p52经过核易位调控靶基因表达[16]。

2 硬骨鱼NF-κB信号通路调控机制

2.1 硬骨鱼NF-κB信号传导途径

2.2 硬骨鱼NF-κB的核转录调控作用

核转录因子NF-κB在没有诱导信号的情况下主要定位于细胞质中。肿瘤坏死因子-α或白介素-1等炎性细胞因子刺激细胞后，可诱导NF-κB的抑制因子IκB降解，引起NF-κB的核蓄积和特定基因表达的调节，而IκB的降解最初由IκB激酶诱导的磷酸化控制，这个过程包括泛素化和随后蛋白酶体对抑制剂的蛋白水解[25]。NF-κB一旦进入细胞核，活化的NF-κB经历一系列翻译后修饰，包括磷酸化、乙酰化和甲基化，而这些修饰调节NF-κB活性的强度和持续时间。活化的NF-κB与靶基因中的特定DNA序列(称为κB元件)结合，并调节涉及免疫调节、生长调节、炎症、致癌和凋亡等500多个基因的转录(图2为NF-κB调控的一些基因产物)，在硬骨鱼中已报道的受NF-κB调控的基因用红色标出[26-28]，不难发现，硬骨鱼中受NF-κB调控的基因还有待深入研究。NF-κB的激活可以影响其下游的免疫相关基因的表达，如在草鱼幼鱼肠道中NF-κB通路可以影响肿瘤坏死因子-α、白介素-1β，IKKβ和c-Rel等mRNA水平的表达[29-30]。在鲤鱼中NF-κBp65基因表达被增强后，NF-κB通路被激活导致炎性相关细胞因子基因(即白介素-1β、白介素-6、白介素-10)表达增加[31]。Kong等[32]对褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)中的白介素-6启动子进行表征，结果表明，p65亚基调控了白介素-6的转录，即NF-κB通路参与了白介素-6的表达调控。

图2 NF-κB调控的一些基因产物

3 硬骨鱼NF-κB免疫应答

3.1 营养因素影响NF-κB免疫应答

硬骨鱼的头肾、肝脏、脾脏、肠黏膜等是其重要的免疫相关器官，如鱼类摄入营养素不足，会影响NF-κB通路免疫应答，进而影响组织器官免疫功能。研究发现，维生素E缺乏导致草鱼头肾、脾脏和鳃中NF-κB 通路激活，使得白介素-10、转化生长因子-β1、IκBα mRNA表达水平被下调，而促炎性细胞因子白介素-1β、白介素-6、白介素-8表达被上调，结果表明，维生素E缺乏将介导草鱼NF-κB信号通路影响草鱼免疫功能[33-34]。Feng等[35]研究表明，草鱼膳食烟酸缺乏会激活NF-κB通路，通过上调促炎细胞因子(肿瘤坏死因子-α、白介素-1β、干扰素-γ2和白介素-8)在鱼肠中表达和下调抗炎细胞因子(白介素-10和转化生长因子-β1)的表达，影响草鱼肠道免疫。而在草鱼日粮中添加苯丙氨酸后，可在全段肠通过NF-κB信号通路下调促炎细胞因子同时上调抗炎细胞因子的表达，从而改善草鱼肠道免疫状态[36]。Li等[37]发现，乌鳢(Channaargus)肝脏和脾脏中肿瘤坏死因子-α、白介素-1β和白介素-8等炎症相关基因的表达会受到微量元素硒(Se)的影响，与对照组相比，乌鳢肝脏和脾脏被硒诱导后上调p65、肿瘤坏死因子-α、白介素-1β和白介素-8的基因表达，同时下调了IκBα的基因表达，最终诱导炎症的发生。而Liu等[38]在饲料中添加谷氨酰胺饲喂大菱鲆(Scophthalmusmaximus)后，在其肠中发现NF-κB信号通路被抑制可以增强肠道屏障功能，同时NF-κB核易位的减少还可以抑制炎症从而减轻肠病。

3.2 有毒物质和污染物

在鱼类肝脏中NF-κB通路也调控着相关免疫基因的表达，如Guo等[39]发现，斑马鱼暴露于全氟辛烷磺酰基化合物(PFOS)中，鱼肝脏中的NF-κB水平均显著高于对照组；同时伴随NF-κB的活化IκBα基因表达强烈下调，p65、白介素-15、转化生长因子-β的mRNA表达水平显著增加，白介素-1β、肿瘤坏死因子-α表达均显著增强。还有研究发现，斑马鱼肝脏中NF-κB通路在镉的暴露下被抑制，导致炎症细胞因子表达降低影响斑马鱼的炎症反应[40]。在硬骨鱼中，有研究者利用H2O2在斑马鱼中建立慢性炎症作用模型，发现H2O2通过激活NF-κB通路从而诱导编码促炎介质的基因(包括白介素-1β)的表达[41]。还有研究者将NF-κB特异性抑制剂吡咯烷二硫基甲酸盐(PDTC)预处理建鲤(Cyprinuscarpiovar.jian)精密切割肝切片，然后再将其用CCl4处理，发现NF-κB信号通路炎症细胞因子以及由NF-κB信号通路调节的下游炎症细胞因子白介素-1β、白介素-6和白介素-8相应地显著下调，NF-κB通路被抑制的切片与对照组切片相比活力显著增加。表明抑制NF-κB信号通路激活可以下调炎性细胞因子表达进而减轻CCl4诱导的鱼肝炎症[42]。甘海燕等[43]发现，斑马鱼被生活污水处理后，NF-κB的表达上调并激活从而促进炎症反应。

3.3 免疫刺激物及病原

有研究表明，在草鱼饲料中添加大豆β-球蛋白可以增强其肠组织p65核移位，升高促炎细胞因子和降低抗炎细胞因子mRNA水平，继而引起全肠段肠道炎症[44]。还有研究发现，斑马鱼在迟钝爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)保护性免疫原诱导下，激活NF-κB通路使得白介素-1β、白介素-6和白介素-8等天然免疫基因的表达相比于非保护性免疫原有更高和更持久的免疫反应[45]。在聚肌胞苷酸和脂多糖的刺激下，草鱼各组织中的p65、p105和c-Rel的表达水平均呈现上调，说明NF-κB与草鱼的抗病毒或抗菌的生理过程有关[23]。另外Zhang等[46]在转基因荧光斑马鱼卵黄中注入脂多糖后，提取RNA进行定量分析发现，NF-κB通路IκBα的表达显著降低，而p65升高；同时细胞因子白介素-1β、白介素-6、肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ的mRNA水平显著升高，白介素-10的表达明显减少。再进行斑马鱼活体荧光成像也发现，卵黄囊中的中性粒细胞炎症活性显著增加。Zheng等[47]从草鱼头肾中分离白细胞，将其经过脂多糖处理后发现，NF-κB、IKKα和IKKγ的mRNA表达显著增加，NF-κB通路被激活导致促炎性细胞因子白介素8和肿瘤坏死因子-α mRNA表达也显著上调，从而促进白细胞炎症反应。Jiang等[48]利用脂多糖对建鲤进行免疫刺激后发现，鱼肠中肿瘤坏死因子-α、白介素-1β、白介素-8的相对mRNA表达水平被上调，同时NF-κB通路被激活促进白介素-1β的表达上调，进一步导致炎症反应加剧，从而引起鱼的肠炎。Shanaka等[49]在许氏平鲉(Sebastesschlegelii)中发现，多种免疫刺激物(包括聚肌胞苷酸、脂多糖)和海豚链球菌(Streptococcusiniae)均可引起NF-κB转录因子的激活。健康鱼体内NF-κB2在肝脏组织中表达量最高，IκBα在肾中表达量最高，草鱼经过草鱼呼肠孤病毒(GCRV)感染后，NF-κB2在肠道中出现了显著的上调表达；IκBα在肝脏中产生了显著的下调表达，在肠道中出现了小幅度的上调表达；尽管具体应答机制还不明确，但这些结果可能指示，NF-κB通路经病毒感染后的肝脏和肠道中产生了主要的免疫应答[50]。然而有研究者用迟钝爱德华菌诱导虹鳟(Oncorhynchusmykiss)肝癌细胞系(RTH-149细胞)时发现，虹鳟去泛素化酶(CYLD)对于NF-κB的激活具有抑制作用[51]。

3.4 其他影响免疫调节

在鱼类和哺乳动物中均发现，一些抗氧化物质可以抑制NF-κB的激活，导致NO、白介素-1β的表达降低影响炎症反应[52-53]。有研究发现，抗生素氟苯尼考(FFC)可以下调NF-κB信号通路抑制脂多糖诱导的炎性细胞因子肿瘤坏死因子-α、白介素-6、白介素-1β的表达，从而表现出抗炎作用[54]，而鲤原代巨噬细胞在恩诺沙星、四环素等抗生素的作用下却可导致NF-κB的激活[15]。而在当前寻找替代抗生素的背景下，有研究发现，通过添加一种新益生菌的饲料投喂斑马鱼，在其肝脏中诱导了天然免疫相关基因(白介素-1β、白介素-6、肿瘤坏死因子-α、白介素-10、白介素-21、NF-κB)的表达，而且发现溶菌酶和补体C3b活性增强，经益生菌处理的试验鱼在感染嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)和海豚链球菌后存活率高于对照鱼。这可能是通过NF-κB信号通路调节斑马鱼对致病菌的天然免疫[55]。另外Rastgar等[56]通过使用NF-κB拮抗剂吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(PDTC)处理自波斯鲟(Acipenserpersicus)头肾中分离培养的巨噬细胞，消除了NF-κB的作用，最终导致巨噬细胞吞噬活性降低。有趣的是鱼体内脂肪过多时将导致脂肪因子表达失调，此时白色脂肪组织具有免疫活性，Sun等[57]发现，在草鱼白色脂肪细胞由其前脂肪细胞分化过程中伴随NF-κB信号通路的激活，并且在脂肪形成过程中NF-κB的水平升高，这说明NF-κB信号通路可能通过影响草鱼脂肪细胞分化进而影响脂肪积累时的免疫功能。

4 硬骨鱼NF-κB调控细胞凋亡

4.1 氧化应激过程中的调控作用

NF-κB信号通路有着重要的细胞凋亡调控功能，它可以调控下游炎症相关细胞因子参与细胞凋亡，也可以与其他通路相互串扰调控凋亡过程，在对抗氧化应激和自由基的细胞毒性方面有重要调控作用。Ivanova等[58]发现，NF-κB亚单位RelA、IκBα存在于线粒体内，两者共同参与防止缺氧早期细胞凋亡。另外有研究发现，NF-κB亚单位RelA或RelB的过度表达可显著拮抗p53诱导的人结肠癌细胞(HCT116细胞)Bax启动子活性，而通过抑制NF-κB可增强Bax的表达，表明NF-κB信号通路参与Bax诱导的线粒体凋亡[59]。Li等[60]利用斑马鱼胚胎模型，通过偶氮二异丁脒盐酸盐(AAPH，偶氮化合物，会刺激细胞产生大量的活性氧，在体外或体内可以诱导氧化应激)诱导活性氧产生引发细胞毒性，但加入NF-κB抑制剂抑制该通路后，斑马鱼胚胎活性氧的产生相较于对照组大幅降低，即通过抑制该通路可以减弱活性氧对机体引起的抗氧化应激，减弱细胞毒性。在另一项研究中发现，H2O2诱导细胞产生活性氧促进NF-κB的磷酸化和p65的转运，而3-溴-4，5-二羟基苯甲醛(BDB，具有清除羟基和烷基自由基的活性)可抑制这个过程，明显抑制NF-κB通路的激活。该结果提示，BDB通过调节NF-κB途径抑制H2O2诱导的细胞凋亡[61]。而Jaafaru等[62]发现，上调神经细胞中参与NF-κB途径的组成性信号传导的转录因子(c-ReL和p52)的表达，可以增加细胞在H2O2毒性环境中存活率。另外，Jia等[63]用CCl4诱导鲤肝脏形成高活性自由基引起氧化应激，触发肿瘤坏死因子-α释放并增加Toll样受体4水平，然后激活NF-κB刺激一氧化氮合酶、白介素-1β和白介素-12的表达引起细胞炎症和坏死，而高水平的肿瘤坏死因子-α还会激活肝细胞凋亡。

4.2 其他影响因素下的调控作用

同样，营养性因素也可以影响NF-κB信号通路调节细胞凋亡，有研究发现，维生素E缺乏将介导草鱼NF-κB信号通路上调草鱼头肾、脾脏和皮肤中天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-2，3，7，8 mRNA的水平诱导细胞凋亡[33]。Zhang等[64]用大豆浓缩蛋白和棉籽浓缩蛋白组成的植物蛋白混合物完全替代鱼粉的日粮饲喂花鲈(Lateolabraxmaculatus)，结果其肝脏中NF-κB通路被激活促使caspase-8表达上调，这预示NF-κB介导外源性途径(caspase8/caspase3)促进肝细胞凋亡。另外，Silva等[65]发现，美人鱼发光杆菌杀鱼亚种(Photobacteriumdamselaessp.piscicida)的主要毒力因子AIP56(56 ku的凋亡诱导蛋白，可以切割p65的锌金属蛋白酶)可以介导欧洲舌齿鲈(Dicentrarchuslabrax)腹膜白细胞(由约70%的巨噬细胞和20%的中性粒细胞组成，并有少量的嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和红细胞)p65的裂解，通过干扰NF-κB通路导致巨噬细胞和中性粒细胞凋亡。NF-κB信号通路在防止热应激诱导的炎性细胞因子生成和细胞凋亡中起着重要作用。有研究者对牛进行热应激时发现，NF-κB通路被抑制，白介素-2、白介素-12等促炎介质和caspase-3等细胞凋亡参数显著降低，抗凋亡基因Bcl-2表达增强，从而阻止细胞凋亡[66]。然而目前还没有在水产动物中研究热应激对NF-κB信号通路的影响，在当前全球气候变暖的趋势下，进行这方面的研究还是很有意义的。在哺乳动物中NF-κB信号通路还可以在剥夺糖氧再恢复氧应激[67]、神经毒素[68]、特异性磷酸酶(PTEN)[69]等因素作用下调控细胞凋亡。在硬骨鱼中，NF-κB信号通路很可能在其他影响因素介导下调控细胞凋亡。

5 展 望

综上所述，NF-κB信号通路是一个经典的也是非常重要的信号转导通路，在影响细胞的炎症反应，免疫应答以及凋亡等方面有着重要地位。但在鱼类中NF-κB信号通路相关机制上的研究还不够充分，尽管如此，NF-κB信号通路在鱼类疾病防控中的研究依然重要。该通路可以调控免疫相关活性分子的生成直接参与机体免疫应答，还可以通过应激反应和其他因素影响组织细胞的凋亡，而这些影响都涉及机体免疫功能。因此进一步研究NF-κB信号通路在硬骨鱼中的调控网络及转导途径，有助于解释鱼类免疫应答过程和机制，然后通过人为调控NF-κB信号通路，增强鱼类的抗病能力。