LPS经TLR4通路引起脓毒症相关的急性肾损伤（SA-AKI）的分子机制研究进展

朱雨杉，周乐汀，王 凉

（南京医科大学附属无锡人民医院肾脏内科，江苏 无锡 214000）

脓毒症是宿主感染后引起的全身炎症反应综合征，发病后易引起多器官功能障碍，其中肾脏最常累及，可引起脓毒症相关的急性肾损伤（acute kidney injury，SA-AKI）[1]。SA-AKI已被认定为是脓毒症的致命并发症，并且其在脓毒症患者中表现为较高发病率及死亡率，可达60%～80%[2-4]。在SA-AKI中，革兰氏阴性菌感染较为普遍。而多数革兰氏阴性菌致病能力与其细胞壁最外层的成分——脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）相关[5]。Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）是参与LPS识别和信号启动的关键受体。本篇综述主要讲述LPS通过TLR4通路引起SA-AKI的分子机制，有望从此方向入手研究靶向药物，对SA-AKI针对性治疗，改善患者预后，提高患者生活质量，降低死亡率。

1 LPS组成结构

LPS，又称内毒素，位于革兰氏阴性菌外壁最外层，毒性成分主要为脂质A。其可启动机体炎症反应，引起大量炎症因子释放，从而造成发热、微循环障碍、内毒素血症等一系列机体机能紊乱，甚至导致休克和多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS），进而危及生命。

LPS是一种经典的病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMPs），它由脂质A、短核心低聚糖和O抗原多糖三个不同区域组成，其中脂质A结构域是TLR4识别LPS时的主要部分。在不同结构LPS中，有6个脂质链的LPS最容易激活TLR4信号。单磷酸基脂质A 较之去掉一个磷酸基，但是其炎症活性较一般LPS明显降低，表现出低毒性，但仍具有免疫刺激特性，可用作人类疫苗佐剂[6]。

2 LPS激活TLR4信号通路

LPS首先被LPS结合蛋白（recombinant lipopolysaccharide binding protein，LBP）识别，LBP通过复合物结合的形式把LPS传递给白细胞分化抗原CD14。CD14可将LPS聚集物分解成单体分子，并将LPS呈给TLR4-MD2复合物。TLR4-MD2复合物与LPS结合可以引起核转录因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）、干扰素调节因子（interferon regulatory factor 3，IRF3）等与TLR4相关的多种信号通路成分的激活，进而产生促炎细胞因子，引起一系列炎症反应，对机体造成损伤。

2.1 LBP被识别

当LPS进入宿主后，首先被血清中的LBP从细菌外壁和囊泡识别提取，形成LBP-LPS复合物。LBP是一种I型急性期蛋白，可在宿主感染、烧伤、手术、创伤等情况下出现，其可迅速诱发机体以防御为主的非特异性反应。其灵敏度较高，即急性炎症反应时，LPS浓度较低水平，LBP也会升高[7]。脓毒症可引发全身炎症反应，而单独LBP对组织损伤发展无较大影响，但其作为LPS载体，可反馈细胞及全身对LPS反应调节作用，并且肾脏及肝脏等多个器官部分类型细胞有助于LBP合成，从而将促进局部炎症扩大，导致患者较易出现长期炎症状态，进而扩大脓毒症对机体危害程度，引起患者发生SA-AKI[5]（见图1）。

图1 流程图

2.2 LBP经CD14传递

CD14是一种模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR），被认为是TLR4激活位点，有膜结合形式和可溶性形式两种形式[8]。

LBP通过LBP-LPS复合物形式把LPS传递给CD14。CD14可将LPS聚合物转变为单体分子，使LPS更易被识别[9]。随后，结合CD14的单个LPS分子以TLR4依赖方式转移至骨髓分化因子2（myeloid differentiation protein-2，MD2）上。CD14自身不会和LPS结合，也不会直接和LBP结合，只有在LPS存在情况下，CD14才对LBP表现为较高结合亲和力。而在LPS转移后，CD14会立即从LBP-LPS胶束复合物中分离，而LBP在多轮LPS转移过程中仍会与LPS结合。LPS从CD14转移到MD2是必需的，而若TLR4缺失，CD14也可将LPS转移到MD2，但数量有限[10]。

在脓毒症开始阶段，血清可溶性CD14浓度升高，以防止感染扩散[11]。有研究表明，即便在低浓度LPS中，若同时有可溶性CD14和LBP存在，近端小管细胞对LPS激活敏感性能高达100倍；而可溶性CD14和LBP的存在也是诱导管状细胞凋亡的必要条件[12]。而在脓毒症发生过程中，肾小管损伤可由AKI进行传播蔓延，并以肾小管发生急性损伤、肾小管细胞死亡及坏死细胞进入腔内为特征，造成肾小管细胞凋亡后，其胞内线粒体功能发生异常，从而将导致局部微循环障碍及氧化应激，进而可造成SA-AKI，同时因线粒体功能异常，将造成患者肾脏ATP合成异常，进一步恶化患者病症[13-14]。

2.3 LBP与TLR4-MD2复合物结合

在与LPS结合之前，MD2与TLR4胞外结构域形成稳定的异源二聚体。与LPS结合会引起TLR4-MD2复合物二聚化。MD2比TLR4小，是TLR4-MD2受体复合物的主要LPS结合模块。它主要通过氢键、电荷等亲水性相互作用与TLR4结合。参与这种相互作用的残基突变会阻断TLR4和 MD2结合以及LPS信号传导，从而可降低炎症因子释放水平，改善患者脓毒症症状，进而避免或降低发生SA-AKI概率[6]。

TLRs是I型跨膜受体，其胞外区域有一个马蹄形的螺线管结构，负责识别各种微生物分子的共同结构模式。例如，TLR3可识别病毒双链RNAs，TLR4-MD2复合物可识别LPS，TLR5可识别细菌鞭毛蛋白，TLR7或TLR8可识别病毒和细菌单链RNAs[15]。TLRs胞内结构域与白细胞介素-1受体（IL-1R）家族具有大量的序列和结构同源性，被命名为Toll/IL-1R同源性（TIR）域[6]。

脓毒症发生过程中，患者发生全身炎症反应，主要为LPS与TLR-4相结合后，激活与TLR-4相关信号通路，从而引起趋化性细胞因子及肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）等量释放，因TNF-α为触发全身炎症反应关键因子，可直接诱导多种炎性因子释放，故其水平在机体内大量升高，将触发炎症级联反应，进而加重炎症反应，引起全身炎症反应发生[16]。TAK-242是toll样受体4介导的信号转导小分子抑制剂，可选择性地结合TLR4细胞内区域[17]，而干扰CD14与 TLR-4复合物介导的信号转导，则可直接抑制LPS与TLR-4结合，从而可避免与TLR-4相关信号通路被激活，故可减缓炎性因子释放，进而降低机体炎症反应。在动物模型中，TAK-242可以抑制血清TNF-α、IL-1、IL-6[18]，但是在临床研究中，TAK-242不能抑制脓毒症、休克或呼吸衰竭患者的细胞因子水平[19]。

一些具有4个脂质链的脂质A衍生物可与TLR4-MD2复合物竞争结合[6]，如脂质IVa和Eritoran（E5564）。脂质IVa是LPS的前体形式，是 MD2配体，可作为人TLR4 -MD2的拮抗剂。E5564是一种合成脂质A拮抗剂，可与LPS竞争性结合TLR4 -MD2复合物。但是在目前临床研究中，应用E5564并没有降低SA-AKI患者的死亡率，改善预后[20]。

2.4 LBP激活TLR4下游信号通路

与LPS结合的TLR4形成同源二聚体，并通过受体和配体之间的TIR结构域相互作用，启动细胞内两条信号通路：髓样分化因子88（myeloiddifferentiationfactor88，MyD88）依赖信号通路和TRIF（Toll/IL-1受体结构域接头分子）依赖信号通路[21]。

在与LPS结合后，TLR4的TIR结构域与MyD88的TIR结构域相互作用，并与另一种含有TIR的接合蛋白（Mal）相互作用。MyD88参与除TLR3外所有TLRs启动的信号通路。在MyD88依赖通路中，只有那些涉及TLR2和TLR4的通路需要Mal来实现有效信号转导[6]。MyD88可与白介素-1受体激酶1（interleukin-1 receptor associated kinase-1，IRAK1）及白介素-1受体激酶4（interleukin-1 receptor associated kinase-4，IRAK4）形成复合物，进而激活肿瘤坏死因子受体活化因子6（yumor necrosis factor-associated factor 6，TRAF6），导致下游NF-κB抑制蛋白激酶（ inhibitory nuclear factorkappa B kinase，IKK）复合物、丝裂原激活的蛋白激酶/MAP激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和 PI3K/Akt信号通路的激活。IKK的激活引起NF-κB核易位，从而引起炎症因子的释放。PI3K（磷脂酰肌醇激酶3）激活Akt，导致p65磷酸化从而激活NF-κB通路。NF-κB是多种炎性因子关键转录调控因子，在脓毒症过程中，其被激活可引起炎性级联反应。MAPK通路主要是JNK（c-Jun N端激酶）激活AP-1（激活因子l）引起炎症因子的释放。在TRIF依赖的信号通路中，TRIF相关的接头分子（TRAM）识别TLR4的TIR结构域，引起干扰素调控因子3（interferonregulatory factor 3，IRF-3）磷酸化，磷酸化的IRF-3转移到细胞核内启动干扰素（interferon，IFN）基因的转录，进一步促进炎症反应[6，22]。多种炎性介质被释放，发生炎症级联反应，则会加重炎性反应，从而易引起机体发生全身炎症反应综合征，其正是脓毒症主要特征，同时炎症级联反应可将炎性反应信号逐步放大，从而引起机体细胞生理功能紊乱，进而造成患者肾脏功能急性衰退，引发SA-AKI。

3 TLR4下游靶点及相关信号通路

除TLR4识别LPS过程中存在可考虑的靶点，其下游信号应答也有些靶点需要注意。

3.1 核转录因子 κB（NF-κB）

NF-κB为多种炎性因子的关键转录因子，能诱导 TNF-α、IL-1、IL-6和 IL-8的合成和释放[23]。动物实验证明直接抑制NF-κB可以降低炎症因子水平[24]。在大鼠原代近端小管上皮细胞上，NF-κB在LPS诱导的单核细胞趋化蛋白-1 （monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）转录中起关键作用，激活蛋白（activator protein 1，AP-1）和序列特异性转录因子（transcription factor Sp1，Sp1）在MCP-1的基础表达中起关键作用。关于TLR4/NF-κB信号通路，在脓毒症过程中，LPS经感染部位或远端损伤部位通过肾小管滤过等作用进入肾小管，随后引起肾脏广泛表达TLR4，并识别LPS，从而激活NF-κB，同时有研究表明NF-κB可诱导多种炎性因子转录，从而触发炎性级联反应，造成肾脏炎症环境[25]。NF-κB是经内质网（endoplasmic reticulum，ER）的信号途径被激活，其中包括PKR样ER应激激酶、活化转录因子6及肌醇需求酶1等应激信号通路，而该三种应激信号通路均参与包含脓毒症在内的多种疾病[26]。此外，ER具备蛋白质合成等作用，当机体受到感染等有害刺激时，则会造成ER应激反应，即ER管腔紊乱，而改善机体ER应激则有利于抑制机体早期炎症反应，从而改善SA-AKI预后[25]。但肾脏中炎性细胞因子的水平更可能是受到全身炎症反应，而不是局部反应的影响[27]。因此降低全身的NF-κB相对来说更为重要。另有研究表明增加三结构域蛋白27（tripartite motif 27，TRIM27）的表达可以显著抑制TLR4/NF-κB信号通路的活性，从而发挥抗炎和抗凋亡作用，能有效缓解LPS诱导的HK-2细胞损伤和小鼠AKI[28]。

3.2 碱性磷酸酶（ALP）

外源性ALP最初用于治疗脓毒症不合并AKI的患者，但在脓毒症动物模型研究中，ALP可通过TLR4通路减弱先天免疫反应，其优势有二，一是明显降低炎症因子水平，其中TNF-α的释放可降低98%，这意味着预期治疗效果较好；二是耐受量大，意味着治疗区间大[29]。但有研究表明对于脓毒症相关急性肾损伤，应用ALP后血浆肌酐短期内降低，AKI生物标志物水平在短期内得到改善，但未改善尿量减少问题。总的来说，ALP有一定的保护作用，但治疗效果并未达到预期效果[30]。

3.3 转化生长因子-β（TGF-β）与内皮—间充质转化（EndMT）

TGF-β可诱导EndMT[31]。EndMT可促进肾成纤维细胞出现，从而促进肾纤维化，引起慢性肾功能不全[32]。暴露于LPS的内皮细胞与TGF-β处理的内皮细胞发生相同表型变化，提示LPS在诱导EndMT中存有潜在作用[33]。此外，肾周细胞为管周毛细血管内的常驻基质细胞，可稳定内皮细胞，且其与脓毒症相关血管不稳定剂渗漏中发挥关键作用，而脓毒症过程中，将破坏肾周细胞与内皮细胞之间的相互作用，从而造成微血管呈高通透性[34]。虽肾周细胞无特异性标志物，但普遍认为络氨酸激酶为其分离的标志物，且有研究表明，当肾周细胞损伤后，络氨酸激酶将从内皮分离，从而促进肾纤维化[5]。肾纤维化为组织修复常见过程，但在脓毒症过程中，大量且持续性炎症反应将造成SA-AKI。

3.4 肿瘤坏死因子受体1（TNFR-1）与Caspase

研究表明TNFR-1基因敲除小鼠对LPS诱导脓毒症性AKI具有耐药性，与正常组相比，小鼠肾细胞凋亡、中性粒细胞浸润均较少，提示TNFR-1在脓毒性AKI坏死和凋亡中起到直接作用。在TNFR-1下游，HK-2细胞凋亡可能部分依赖于Fas和Caspase表达。脓毒症AKI患者血液中Fas、Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9水平均显著升高，通过树脂吸附可下调上述炎症物质介导信号通路的激活，从而达到减少细胞凋亡及抑制炎症来保护肾脏效果[35-36]。

TNFR-1/Caspase通路为促炎反应重要信号通道，有研究表明，外周血单个核细胞（NLRP3）可激活此通道，故抑制NLRP3的激活，可对炎性反应靶点进行有效抑制[37]。TNFR-1与TNF-α相关，而TNF-α为一种促炎因子，其可促进多种免疫因子表达，有研究表明其在炎症反应中产生最快，且达峰时间最早，是促进全身反应综合征的重要因素[38]。Caspase为细胞凋亡必要效应蛋白酶，当TNFR-1被激活产生炎症因子时，其可通过作用于细胞凋亡及炎症通路，从而参与细胞凋亡小体形成过程，造成肾脏细胞自噬及凋亡加剧，进而引起肾损伤程度加深[39]。

3.5 其他

TLR4/MyD88信号通路是多种炎性反应所经途径。高迁移率蛋白B1为一种促炎因子，当细胞发生损伤，其将被释放到细胞外，从而识别TLR4受体并结合MyD88传递相关信息，以参与机体炎症反应及细胞凋亡[40]。此外，IL-33基因修饰的骨髓间充质干细胞（bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs）可显著改善脓毒症AKI大鼠的肾功能，其机制可能与IL-33调控TLR4/MyD88信号通路、抑制肾脏炎症反应有关[41]。SA-AKI小鼠肾白介素-10表达增加，调节性T细胞增殖增加，同时存在大量免疫细胞凋亡，阻断白细胞介素-10可挽减少脓毒症小鼠急性肾损伤[42]。

4 小结

目前SA-AKI的防治以应用抗生素、控制感染、液体治疗及肾脏替代治疗等对症支持治疗为主[2]，效果有限，尚缺乏靶向治疗药物。对于靶向药物研究，TLR4识别LPS阶段看似更具对肾脏保护作用，但是目前该类相关药物在临床上未能出现明显治疗作用，有效靶向治疗药物有待进一步研发；对于TLR4通路下游信号研究较多，但是机制尚不清楚，TLR4/NF-κB通路方面研究最多，有些已经面市药物也被证明具备通过TLR4/NF-κB通路抑制炎症的作用，但具体疗效有待进一步探寻。