发酵条件对三七叶发酵茶活性物质的影响及抗氧化研究

陈红惠，向德健，高明菊，杨光领，龚雄彪

文山学院三七医药学院 （文山 663099）

三七叶，为五加科植物三七的叶，三七叶味稍带苦味，不仅可用做茶饮，也可作为药用，药性比较温和，且毒副作用较小。现代药理学研究表明，三七叶具有安神、抗氧化、抗衰老等功效[1-3]。三七叶用于治疗跌打损伤、止血，研磨后敷在伤口上可以止血，功能和三七根相差不大。三七叶中除以皂苷成分为主外，还含有多酚、多糖、黄酮等活性成分[4-7]。目前，三七类产品被相继研发出来，应用于不同的领域，主要有生活用品类、跌打损伤类和临床类药物，如三七牙膏[8]、三七散[9]、血塞通注射剂、血塞通胶囊等；在食品开发领域，三七叶类产品也相继出现，如三七叶蜂蜜龟苓膏[10]、三七叶保健软糖、三七叶花生酥糖[11-12]、三七茎叶红茶饮料[13]、三七叶含片[14]等。

黑曲霉是安全的发酵微生物，适用于固态发酵，可生产淀粉酶、纤维素酶、柠檬酸等，用于发酵茶，发酵出来的茶的茶性比较温和，口感显香甜、风味醇厚且独特。三七叶作为三七的副产物，一直没能得到有效的开发和利用。研究以三七叶为原料，经过不同的制茶工艺后以黑曲霉发酵，得到三七叶发酵茶，不仅可以开发文山地方特色资源，提高三七的利用价值，还可以提高产物利用率，这对拓展三七叶食品市场、促进三七产业发展具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

三七叶产于云南文山；黑曲霉菌种：分离于云南普洱茶，经多代培养纯化后并测序鉴定。

1.1.2 试剂

芦丁（上海源叶生物科技有限公司）；标准品人参皂苷Rb1（上海Aladdin公司）；没食子酸、福林酚、香草醛、冰醋酸（上海易恩化学技术有限公司）；冰醋酸、高氯酸、抗坏血酸、95%乙醇（山东鑫九诚化工科技有限公司）；Tris（上海金穗生物科技有限公司）；邻苯三酚、盐酸、硫酸亚铁、过氧化氢、水杨酸（湖北艺康源化工有限公司）。以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

MB90快速水分测试仪[奥豪斯仪器（常州）有限公司]；鼓风恒温干燥箱（上海龙跃仪器设备有限公司）；超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；离心机（上海安亭科学仪器厂）；粉碎机（九阳股份有限公司）；V-5100型可见光分光光度计（广州沪瑞明仪器有限公司）；MJ-70-1霉菌培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）。

1.3 黑曲霉孢子菌悬液的制备

制作PDA培养基，将培养基以及需要用到的试剂、工具全部置于无菌操作台上，紫外线消毒30 min，确保无杂菌污染，在无菌操作台上接种黑曲霉，放入温度为28 ℃、水分湿度85%的霉菌培养箱，培养至黑曲霉长满培养皿为止。取出培养好的培养皿，用移液管吸取5 mL生理盐水放入黑曲霉培养皿中，用接种针在斜面上轻轻刮取，将菌悬液倒入盛有生理盐水的三角烧瓶中，充分振荡，随后用无菌脱脂棉和漏斗过滤，除去菌丝，将菌悬液稀释到1.0×107CFU/mL。

1.4 三七叶发酵茶的制备工艺

1.4.1 工艺流程

1.4.2 操作要点

原料选择：选择鲜嫩且小的三七叶片。

杀青：杀青有炒青与蒸青两种[15]方式。炒青：将洗净后的叶子沥干水分，放入大锅小火慢炒，并不断地翻炒；蒸青：将沥干水分的叶子薄薄地铺在蒸锅里，水蒸气上来后放入锅里蒸三分钟左右抬起，蒸出来的叶子水分太高不易揉捻成型，把叶子放入30 ℃鼓风恒温干燥箱中干燥3～5 min拿出。

揉捻：将经过蒸青或炒青的叶子放在簸箕内不断揉搓，直至成蜷条状，不会散为止。

高温灭菌：将揉捻好的三七叶放在温度为105 ℃的高温灭菌锅内灭菌15 min。

称取一定量经灭菌处理后的三七叶茶于培养瓶中，压紧，按照接种量将稀释后的菌悬液喷洒到三七叶上，用保鲜膜密封，扎上一定数量的小孔，放入培养箱中培养。

1.5 试验方法

1.5.1 不同发酵条件下发酵三七叶发酵茶

1.5.1.1 不同杀青方式对三七叶发酵过程中化学成分的影响

分别取用蒸青、炒青处理过的三七茶叶（茶坯含水量为30%）各30 g放在培养瓶中压紧，接种20%的黑曲霉，在30 ℃条件下发酵5，10，15，20和25 d，分别测定多酚、黄酮、皂苷的含量，并与未发酵的三七叶作对比。

1.5.1.2 不同发酵温度对三七叶发酵过程中化学成分的影响

取30 g经炒青后的三七叶茶（茶坯含水量为30%）放在培养瓶中压紧，接种20%的黑曲霉，分别在25，30，35，40和45 ℃下发酵10 d，分别测定多酚、黄酮、皂苷的含量。

1.5.1.3 不同发酵时间对三七叶发酵过程中化学成分的影响

取30 g经炒青后的三七茶叶放在培养瓶中压紧，接种20%的黑曲霉，茶坯含水量为30%，在30 ℃下分别发酵5，10，15，20和25 d，分别测定多酚、黄酮、皂苷的含量，并与未发酵茶叶的理化指标作对比。

1.5.1.4 不同接种量对三七叶发酵过程中化学成分的影响

取30 g经炒青后的三七叶茶放在培养瓶中压紧，分别接种6%，13%，20%，27%和33%的黑曲霉，茶坯含水量为30%，在30 ℃条件下发酵10 d，分别测定多酚、黄酮、皂苷的含量。

1.5.1.5 不同茶坯含水量对三七叶发酵过程中化学成分的影响

取30 g经炒青后的三七叶茶叶放在培养瓶中压紧，茶坯含水量分别为10%，20%，30%，40%和50%，接种20%的黑曲霉，在30 ℃下发酵10 d，分别测定多酚、黄酮、皂苷的含量。

1.5.2 抗氧化试验

1.5.2.1 超氧阴离子自由基（O2-·）清除试验

参考陈红惠等[20]的方法，有轻微改动。配制浓度为50 mmol/L的Tris-HCl缓冲液，调整其pH为8.2，然后分别取4.5 mL 6份置于各试管中，置于37 ℃水浴锅中加热20 min，加入不同质量浓度样品液（0.00，0.40，0.44，0.48，0.52和0.56 mg/mL）2 mL，各管分别加入0.5 mL邻苯三酚溶液，混合并置于27 ℃水浴锅中水浴6 min，立刻加入盐酸1.0 mL，测量波长为420 nm处的吸光度。测定对照品溶液时，邻苯三酚用蒸馏水代替，其他样品按照上述方式测定样品吸光度计算清除率，用抗坏血酸作为对照。

1.5.2.2 羟基自由基（·OH）清除试验

取2 mL不同质量浓度（0.28，0.32，0.36，0.40和0.44 mg/mL）的样品液，加入硫酸亚铁和过氧化氢溶液各2.0 mL，静置10分钟后，加入2.0 mL水杨酸，30 min后测定吸光度（510 nm）。对照品溶液中用蒸馏水代替水杨酸测量吸光度，其他样品按照上述方式测定样品吸光度计算清除率，用抗坏血酸作为对照。

1.6 主要成分的测定

皂苷的测定：采用香草醛-高氯酸比色法[16-17]测定三七叶总皂苷含量，黄酮的测定：采用三氯化铝法[18]测定三七叶黄酮的含量，多酚的测定：采用福林酚试剂法[19]测定三七叶中的多酚含量。

2 结果与分析

2.1 不同发酵条件对三七叶活性成分的影响

2.1.1 杀青方式对三七叶中活性物质的影响

不同杀青方式对三七叶中活性物质含量的影响见图1。

由图1可知，炒青和蒸青处理对三七叶发酵茶中皂苷、黄酮和多酚含量均有显著性影响（p＜0.05）。通过两种不同杀青方式，三七叶发酵茶中活性物质都在5～10 d内出现含量增加，随着发酵时间的继续延长，其各成分含量均出现较大程度降低，在发酵15 d时含量达到最低，然后继续发酵含量又会有一定提高，这可能是三七叶茶经黑曲霉发酵后，随着发酵进行，黑曲霉代谢逐渐旺盛，会消耗原料中的化学成分，加上在发酵过程中微生物产生多种胞外酶，三七叶中的皂苷、黄酮和多酚均会被氧化而导致含量下降。三七叶通过炒青和蒸青后发酵10 d，蒸青处理过的发酵茶皂苷含量和多酚含量略高与炒青处理的，而炒青过的发酵茶黄酮含量高于蒸青的。结合感官评价，炒青处理温度较高，能带来较多美拉德褐变反应的色泽加深和丰富的香气成分产生的有利结果，故杀青选择炒青方式较好。

2.1.2 温度对三七叶中活性物质的影响

发酵温度对三七叶中活性物质含量的影响见图2。

由图2可知，温度对三七叶发酵茶发酵过程中的化学成分有很大的影响，不同发酵温度对三七叶皂苷、黄酮有显著性差异（p＜0.05）。随着温度的升高，其皂苷和黄酮含量呈先上升下降，在发酵温度为30 ℃时三七叶发酵茶中皂苷和黄酮含量显著高于其他温度下的含量（p＜0.05），在发酵温度为40 ℃时皂苷含量达到最低，而多酚含量随着温度的升高而缓慢增加，但上升的幅度并不大，这可能是由于40～45 ℃温度过高，部分黑曲霉死亡，引起多酚氧化的程度减少使得多酚含量增加，综上可知，温度为30 ℃时为最适发酵温度。

图2 不同发酵温度对三七叶发酵茶活性物质含量的影响

2.1.3 发酵时间对三七叶中活性成分的变化影响

发酵时间对三七叶中活性物质含量的影响见图3。

由图3可知，不同的发酵时间对三七叶发酵茶发酵过程中的化学成分有极大的影响，发酵时间对三七叶皂苷、黄酮有显著性差异（p＜0.05）。随着发酵时间的的延长，其皂苷、黄酮含量也随之增加，与未发酵的三七叶相对比，发酵后的茶叶的皂苷和黄酮含量都高于未发酵茶叶的皂苷含量，并在发酵第15天时皂苷和黄酮含量均达到最大，这可能是由于经过黑曲霉发酵后，原生苷的含量降低，而极性较低的稀有皂苷含量大幅度升高，导致了在发酵过程中皂苷含量不断变化[21]；三七叶茶在发酵过程中黑曲霉中的微生物消耗了三七叶茶中部分蛋白质和淀粉，次生代谢产物损失较少，从而三七叶发酵茶中黄酮含量增加；而三七叶发酵茶中多酚含量呈现一种先减少后趋于平稳的状态，与未发酵时茶叶的多酚含量相对比，发酵后茶叶的多酚含量普遍低于未发酵茶叶的多酚含量，从发酵第10天以后变化不大，综上可知，发酵时间为15 d时为最适发酵时间。

图3 不同发酵时间对三七叶发酵茶活性物质含量的影响

2.1.4 接种量对三七叶中活性成分的变化影响

接种量对三七叶中活性物质含量的影响见图4。

由图4可知，接种量对三七叶发酵茶发酵过程中化学变化有较大影响，接种量与三七叶发酵茶中皂苷、黄酮、多酚有显著性差异（p＜0.05）。随着接种量的升高，其皂苷含量也不断上升，接种量越高，皂苷含量越高，在接种量为33%时，皂苷含量达到最高，这可能是因为随着黑曲霉数量的增多，极性较低的稀有皂苷含量不断增多所致；其黄酮含量随着接种量的升高先缓慢上升后又下降，在接种量为20%时出现最大值，从接种量为27%时开始下降，并在接种量为33%时出现最小值；多酚含量也呈现先上升后下降再上升的趋势。这可能是三七叶茶在发酵过程中黑曲霉中的生长与接种量有关，也与底物成分、代谢物的反馈调节有关，发酵过程中消耗了三七叶中部分蛋白质和淀粉，次生代谢产物损失较少，从而三七叶发酵茶中最后黄酮含量增加。综合考虑，接种量为20%时为最适接种量。

图4 不同接种量对三七叶发酵茶活性物质含量的影响

2.1.5 含水量对三七叶中活性成分的变化影响

含水量对三七叶中活性物质含量的影响见图5。

由图5可知，茶坯含水量对于三七叶发酵茶发酵过程中化学变化有一定的影响，含水量与三七叶发酵茶中黄酮呈现显著性差异（p＜0.05）。随着含水量的升高，三种活性物质含量均呈现先升高后下降的趋势，在含水量30%时各含量均最高，黄酮和多酚含量在含水量达50%时又有所增加，这可能是因为水分含量的高低与霉菌的生长和酶的活性水分有关，随着含水量的升高，原生苷的含量降低，极性较低的稀有皂苷含量大幅度升高，当含水量超过黑曲霉生长的范围，产生的极性较低的稀有皂苷减少所致；在发酵过程中，三七叶茶中的蛋白质、淀粉成分减少时，微生物利用率降低，黄酮、多酚含量升高。综合三种化学成分的总体情况来看，含水量为30%时为最适发酵含水量。

图5 不同含水量对三七叶发酵茶活性物质含量的影响

2.2 三七叶发酵茶抗氧化能力试验

三七叶中的皂苷、黄酮及多酚类物质均含有大量的酚羟基，可以捕获自由基生成稳定的半酮式结构，从而终止自由基链式反应[20]。通过对不同浓度的三七发酵茶提取液进行清除O2-·和·OH试验，结果如图6所示。

图6 不同质量浓度三七发酵茶的抗氧化活性（A）O2-·（B）·OH

由图6可知，三七发酵茶提取液质量浓度增加时其清除O2-·和·OH的能力也增强，清除率与三七叶发酵茶提取液的质量浓度呈正相关，在测试的质量浓度范围内，当质量浓度为0.44 mg/mL时，三七发酵茶对·OH的清除率最高为45.81%。通过回归计算得到三七发酵茶对O2-和·OH的IC50值分别为1.38和0.65 mg/mL，表明三七叶发酵茶清除O2-·和·OH抗氧化能力良好。

3 结论

试验以三七叶为原料，接种黑曲霉进行发酵制备三七叶发酵茶，对该发酵茶在制备过程中的杀青方式、发酵温度、发酵时间、接种量、茶坯含水量与三七叶中活性物质的变化关系进行了研究，结果显示以上条件对三七叶中皂苷、黄酮和多酚含量均有显著性影响（p＜0.05），综合考虑各成分变化情况，三七发酵茶适宜采用炒青进行杀青，在茶坯含水量为30%、黑曲霉接种量为20%、温度为30 ℃条件下发酵15 d，有利于得到品质较高的三七叶发酵茶，对于发酵制得的三七叶茶，表现出良好的抗氧化能力。