缩氨基硫脲衍生物的合成及其生物活性研究*

游遨，肖吉，黄冬婷

（1.广东轻工职业技术学院，广东 广州 510300；2.广东省科学院生物与医学工程研究所，广东 广州 510316；3.广东省绿色制糖工程技术研究中心，广东 广州 510316）

酪氨酸酶（EC 1.14.18.1），广泛存在于自然界中，对人体、动物、植物、菌类和微生物均有重要的生理作用，主要影响生物体内黑色素的生成[1］。在正常生理作用下，黑色素的沉积对人体皮肤对抗紫外线的伤害具有重要意义，但是黑色素的过量生成将导致皮肤问题，诸如雀斑、黄褐斑、老年斑、黑色素瘤等[2］。由于酪氨酸酶是黑色素生成的关键酶，所以它成为了抑制黑色素生成的关键靶标，目前大多数美白化妆品中的关键成分均是酪氨酸酶抑制剂，主要分为熊果苷、曲酸、L-抗坏血酸（Vc）以及鞣花酸等（见图1），熊果苷因其化学上的不稳定性易分解为苯系化合物，对人体有潜在危害[3］，曲酸因其对人体有一定的致癌性而影响使用[4］，L-抗坏血酸（Vc）对热敏感易分解而影响储存及使用[5］，鞣花酸因其溶解度低而影响生物利用度[6］，国内外科研工作者致力于新型酪氨酸酶抑制剂的研发工作[7］。

图1 四种常见的酪氨酸酶抑制剂

酪氨酸酶属于多基因编码蛋白，在不同生物体内表现出的化学结构及分子量均有差异，但是其活性中心基本一致，都是由His61、His85、His94、His259、His263、His294与两个铜离子络合构成[8］。近年来，酪氨酸酶抑制剂的研发工作普遍基于抑制剂与酪氨酸酶活性中心双铜离子的配位作用开展，从而使得酪氨酸酶活性降低，达到抑制效果。基于此，本论文合成14种含有氨基硫脲基团化合物，研究其对酪氨酸酶的抑制作用及构效关系。

1 实验部分

1.1 实验仪器与试剂

核磁共振仪为BrukerAVANCE400，溶剂CDCl3，DMSO-d6，内 标TMS；质 谱 仪 为LCMS-2010A；熔点仪为上海精密科学仪器有限公司WRS-1B数字熔点仪；旋转蒸发仪为EYELA的N-1300V-WB；酶标仪为CMax Plus；磁力搅拌器为IKA的RH basic。

对羟基苯乙酮、乙酰氯丙酰氯、丁酰氯、异丁酰氯、戊酰氯、正己酸、正庚酸等均购置于麦克林试剂公司，氘代试剂（CDCl3，DMSO-d6）购置于阿拉丁试剂，蘑菇酪氨酸酶、L-多巴、测试用DMSO等试剂购置于西格玛公司，其他常用试剂均购置于广州试剂厂。

1.2 化合物的合成

化合物的合成路线如图2所示。实验采用简单的酯化反应在对羟基苯乙酮的酚羟基位置引入不同结构、不同长度的亲脂性基团，随后在化合物苯乙酮的羰基位置引入氨基硫脲基团，最终获得目标化合物。

图2 目标化合物的合成（a： Et3N， CH2Cl2， RT， 30 min；b： CH3COOH， EtOH，80℃， 30 min）

化合物2a-2n的通用合成路径：取3-羟基苯甲醛1.22g（10 mmol）于干燥两口烧瓶中，加入15 mL干燥二氯甲烷作为溶剂，加入三乙胺1.2 g（12 mmol），搅拌使对羟基苯乙酮完全溶解，使用恒压滴液漏斗滴加溶于10 mL二氯甲烷的乙酰氯（12 mmol），10分钟左右滴完，反应30分钟，TLC监测，待反应完全，将反应液倒入去离子水中，取有机相分别使用去离子水、碳酸氢钠溶液以及饱和食盐水洗涤两次，有机相使用无水硫酸钠干燥，柱层析分离得3-乙酰氧基苯甲醛（2a）。同样的方法获得化合物2b-2n。

化合物3a-3n的通用合成路径：取合成的化合物2a（5 mmol）于50 mL圆底烧瓶中，加入研磨成粉末的氨基硫脲（5.5 mmol），加入20 mL 无水乙醇作为溶剂，加入0.5 mL无水乙酸作为催化剂，加热回流，TLC监测，待化合物2a反应完全，将反应液置于冰箱冷藏过夜，过滤得到3-乙酰氧基苯甲醛缩氨基硫脲（3a），用稀盐酸洗涤产物，用甲醇重结晶得纯品。化合物3b-3n用同样的方法获得。

1.3 化合物活性测试

所得化合物对酪氨酸酶抑制活性测试：在1.5 mL的离心管中分别加入890 µL磷酸缓冲溶液（pH=6.8），以及不同浓度的20 µL化合物溶液（DMSO配制），最终溶液中DMSO的浓度为2%，然后加入10 µL酪氨酸酶溶液（用pH=6.8的磷酸缓冲溶液配制，0.5 mg/mL），摇匀，25℃恒温水浴30 min。随后加入80 µL的L-DOPA溶液（1.5 mg/mL），迅速摇匀，然后在25℃恒温条件下测试溶液在475 nm下的光密度值（OD值）变化，测试时间1 min，扣除缓冲溶液对本实验的影响。然后根据OD值增长直线求出其斜率，即酶活力值[9］。加入化合物后的酶活力值与未加入化合物的酶活力值之比为酶相对活力值，见式（1）：

IC50的计算方法：以不加入化合物的斜率值为100%，以加入化合物之后的酶相对活力值对化合物的浓度作图，即得到化合物浓度-酶活力曲线，当酶的剩余活力为50%时，所对应的化合物浓度即为该化合物的IC50值。

1.4 化合物毒性测试

选择对酪氨酸酶抑制活性最好的化合物3a，采用CCK-8方法进行化合物毒性测试。在96孔板中配置100 µL的293T细胞悬液，将96孔板置于37℃、5%二氧化碳条件下的培养箱中预培养24小时；向培养板中加入不同浓度的3a溶液（DMSO配置）10 µL，使化合物终浓度分别为31.25、62.5、125、250、500、1 000 µM，然后将培养板置于培养箱培养24小时；向培养板每个孔加入CCK-8溶液10 µL，将培养板置于培养箱再培养4小时；用酶标仪测试培养板在 450 nm处的吸光度值，做5组平行试验，进行数据处理。

2 数据分析

2.1 化合物结构鉴定

对所合成的化合物3a-3n分别进行结构鉴定，测试14种化合物的熔点、核磁氢谱、核磁碳谱以及质谱。结果如下：

化合物3a：3-乙酰氧基苯甲醛缩胺基硫脲，产物为白色固体，产率81%；m.p. 205.0～206.4； 1H NMR （400 MHz， DMSO-d6） δ 11.49 （s， 1H）， 8.26 （s， 1H）， 8.09 （s， 1H）， 8.05 （s， 1H）， 7.71 （s， 1H）， 7.59 （d， J = 7.7 Hz， 1H）， 7.44 （t， J = 7.8 Hz， 1H）， 7.15 （d， J = 6 Hz 1H）， 2.28 （s， 3H），13C NMR （101 MHz， DMSO） δ 178.57， 169.61， 151.36， 141.57， 136.33， 130.19， 125.83， 123.71， 120.21， 21.30； ESI-MS m/z = 237.5 [M+H］+。

化合物3b：3-丙酰氧基苯甲醛缩胺基硫脲，白色固体，产率78%；m.p. 193.3～193.9； 1H NMR （400 MHz， DMSO-d6） δ 11.49 （s， 1H）， 8.26 （s， 1H）， 8.10 （s， 1H）， 8.04 （s， 1H）， 7.70 （t， J = 1.9 Hz， 1H）， 7.64 - 7.56 （m， 1H）， 7.43 （t， J = 7.9 Hz， 1H）， 7.14 （d， J = 8.0， 1H）， 2.69 - 2.56 （m， 2H）， 1.15 （t， J = 7.5 Hz， 4H）， 13C NMR （101 MHz， DMSO） δ 178.57， 172.95， 151.39， 141.63， 136.29， 130.17， 125.75， 123.70， 120.21， 27.39， 9.29； ESI-MS m/z = 251.5 [M+H］+。

化合物3c：3-丁酰氧基苯甲醛缩胺基硫脲，白色固体，产率73%；m.p. 165.0～165.5； 1H NMR （400 MHz， DMSO-d6） δ 11.49 （s， 1H）， 8.25 （s， 1H）， 8.10 （s， 1H）， 8.05 （s， 1H）， 7.68 （t， J = 1.9 Hz， 1H）， 7.60 （d， J = 7.8 Hz， 1H）， 7.43 （t， J = 7.9 Hz， 1H）， 7.13 （d， J = 8.0 Hz， 1H）， 2.57 （t， J = 7.3 Hz， 2H）， 1.75 - 1.61 （m， 2H）， 0.98 （t， J = 7.4 Hz， 3H），13C NMR （101 MHz， DMSO） δ 178.55， 172.07， 151.33， 141.59， 136.33， 130.18， 125.80， 123.71， 120.21， 35.76， 18.31， 13.89； ESI-MS m/z = 265.5 [M+H］+。

化合物3d：3-异丁酰氧基苯甲醛缩胺基硫脲，白色固体，产率79%；m.p. 181.0～181.8； 1H NMR （400 MHz， DMSO-d6） δ 11.50 （s， 1H）， 8.26 （s， 1H）， 8.10 （s， 1H）， 8.06 （s， 1H）， 7.67 （t， J = 1.9 Hz， 1H）， 7.64 - 7.57 （m， 1H）， 7.44 （t， J = 7.9 Hz， 1H）， 7.17 - 7.19 （m， 1H）， 2.89 - 2.76 （m， 1H）， 1.25 （d， J = 7.0 Hz， 6H），13C NMR （101 MHz， DMSO） δ 178.57， 175.41， 151.44， 141.64， 136.32， 130.19， 125.81， 123.65， 120.13， 33.80， 19.13； ESI-MS m/z = 265.5 [M+H］+。

化合物3e：3-戊酰氧基苯甲醛缩胺基硫脲，白色固体，产率69%；m.p. 138.8～139.5； 1H NMR （400 MHz， DMSO-d6） δ 11.50 （s， 1H）， 8.26 （s， 1H）， 8.10 （s， 1H）， 8.05 （s， 1H）， 7.68 （s， 1H）， 7.60 （d， J = 7.7 Hz， 1H）， 7.44 （t， J = 7.9 Hz， 1H）， 7.16 - 7.10 （m， 1H）， 2.58 （t， J = 7.4 Hz， 2H）， 1.69 - 1.59 （m， 2H）， 1.47 - 1.33 （m， 2H）， 0.92 （t， J = 7.3 Hz， 3H），13C NMR （101 MHz， DMSO） δ 178.57， 172.21， 151.35， 141.60， 136.33， 130.19， 125.78， 123.70， 120.21， 33.66， 26.88， 22.08， 14.12； ESI-MS m/z = 279.5 [M+H］+。

化合物3f：3-己酰氧基苯甲醛缩胺基硫脲，白 色 固 体，产 率72%；m.p. 133.2～134.5； 1H NMR （400 MHz， DMSO-d6） δ 11.49 （s， 1H）， 8.25 （s， 1H）， 8.09 （s， 1H）， 8.05 （d， J = 2.4 Hz， 1H）， 7.68 （s， 1H）， 7.60 （d， J = 7.7 Hz， 1H）， 7.44 （t， J = 7.8 Hz， 1H）， 7.13 （d， J = 7.9Hz， 1H）， 2.64 - 2.53 （m， 2H）， 1.71 - 1.57 （m， 2H）， 1.42 - 1.22 （m， 4H）， 0.97 - 0.78 （m， 3H），13C NMR （101 MHz， DMSO） δ 178.57， 172.22， 151.36， 141.60， 136.34， 130.19， 125.79， 123.70， 120.22， 33.89， 31.09， 24.45， 22.28， 14.29； ESI-MS m/z = 293.3 [M+H］+。

化合物3g：3-庚酰氧基苯甲醛缩胺基硫脲，白色固体，产率75%；m.p. 121.1～122.2； 1H NMR （400 MHz， DMSO-d6） δ 11.50 （s， 1H）， 8.27 （s， 1H）， 8.09 （s， 1H）， 8.04 （s， 1H）， 7.68 （s， 1H）， 7.60 （d， J = 7.7 Hz， 1H）， 7.43 （t， J = 7.9 Hz， 1H）， 7.13 （d， J = 8.1， 1H）， 2.58 （t， J = 7.5 Hz， 2H）， 1.71 - 1.50 （p， J = 7.4 Hz， 2H）， 1.42 - 1.20 （m， 6H）， 0.88 （t， J = 6.7 Hz， 3H）， 13C NMR （101 MHz， DMSO） δ 178.55， 172.20， 151.34， 141.57， 136.33， 130.18， 125.77， 123.68， 120.21， 33.92， 31.39， 28.56， 24.73， 22.42， 14.37； ESI-MS m/z = 307.9 [M+H］+。

化合物3h：3-辛酰氧基苯甲醛缩胺基硫脲，白 色 固 体，产 率68%；m.p. 141.8～142.8； 1H NMR （400 MHz， DMSO-d6） δ 11.51 （s， 1H）， 8.27 （s， 1H）， 8.09 （s， 1H）， 8.05 （s， 1H）， 7.67 （s， 1H）， 7.60 （d， J = 7.7 Hz， 1H）， 7.43 （t， J = 7.9 Hz， 1H）， 7.12 （d， J = 8.0Hz， 1H）， 2.56 （t， J = 7.4 Hz， 2H）， 1.71 - 1.55 （m， 2H）， 1.40 - 1.19 （m， 8H）， 0.86 （t， J = 6.4 Hz， 3H）， 13C NMR （101 MHz， DMSO） δ 178.56， 172.17， 151.34， 141.56， 136.33， 130.16， 125.72， 123.65， 120.22， 33.93， 31.59， 28.87， 24.78， 22.53， 14.40； ESI-MS m/z = 322.1 [M+H］+。

化合物3i：3-壬酰氧基苯甲醛缩胺基硫脲，白 色 固 体，产 率66%；m.p. 144.2～145.4； 1H NMR （400 MHz， DMSO-d6） δ 11.49 （s， 1H）， 8.26 （s， 1H）， 8.09 （s， 1H）， 8.04 （s， 1H）， 7.67 （s， 1H）， 7.60 （d， J = 7.8 Hz， 1H）， 7.43 （t， J = 7.9 Hz， 1H）， 7.12 （dd， J = 8.0， 2.3 Hz， 1H）， 2.57 （t， J = 7.4 Hz， 2H）， 1.70 - 1.57 （m， 2H）， 1.44 - 0.98 （m， 10H）， 0.86 （t， J = 6.6 Hz， 3H），13C NMR （101 MHz， DMSO） δ 178.56， 172.21， 151.34， 141.60， 136.32， 130.19， 125.75， 123.68， 120.21， 33.92， 31.70， 29.13， 29.01， 28.89， 24.76， 22.55， 14.42； ESI-MS m/z = 336.0 [M+H］+。

化合物3j：3-癸酰氧基苯甲醛缩胺基硫脲，白色固体，产率68%；m.p. 132.9～134.4； 1H NMR （400 MHz， DMSO-d6） δ 11.50 （s， 1H）， 8.26 （s， 1H）， 8.08 （s， 1H）， 8.05 （s， 1H）， 7.67 （s， 1H）， 7.60 （d， J = 7.7 Hz， 1H）， 7.43 （t， J = 7.9 Hz， 1H）， 7.12 （dd， J = 8.1， 2.2 Hz， 1H）， 2.57 （t， J = 7.5 Hz， 2H）， 1.70 - 1.57 （m， 2H）， 1.44 - 1.16 （m， 12H）， 0.92 - 0.79 （m， 3H），13C NMR （101 MHz， DMSO） δ 178.56， 172.18， 151.34， 141.58， 136.32， 130.16， 125.72， 123.65， 120.22， 33.93， 31.75， 29.32， 29.19， 29.13， 28.89， 24.77， 22.58， 14.41； ESI-MS m/z = 350.1 [M+H］+。

化合物3k：3-十一酰氧基苯甲醛缩胺基硫脲，白色固体，产率59%；m.p. 125.3～125.7； 1H NMR （400 MHz， DMSO-d6） δ 11.51 （s， 1H）， 8.27 （s， 1H）， 8.08 （s， 1H）， 8.05 （s， 1H）， 7.66 （s， 1H）， 7.61 （d， J = 7.6 Hz， 1H）， 7.42 （t， J = 7.9 Hz， 1H）， 7.11 （d， J = 8.0 Hz， 1H）， 2.56 （t， J = 7.4 Hz， 2H）， 1.70 - 1.56 （m， 2H）， 1.42 - 1.13 （m， 15H）， 0.84 （t， J = 6.5 Hz， 3H），13C NMR （101 MHz， DMSO） δ 178.57， 172.11， 151.34， 141.53， 136.34， 130.12， 125.67， 123.60， 120.23， 33.94， 31.81， 29.47， 29.40， 29.22， 28.93， 24.78， 22.60， 14.40； ESI-MS m/z = 364.1 [M+H］+。

化合物3l：3-十二酰氧基苯甲醛缩胺基硫脲，白色固体，产率58%；m.p. 126.4～127.7； 1H NMR （400 MHz， DMSO-d6） δ 11.49 （s， 1H）， 8.26 （s， 1H）， 8.08 （s， 1H）， 8.05 （s， 1H）， 7.67 （s， 1H）， 7.61 （d， J = 7.6 Hz， 1H）， 7.43 （t， J = 7.9 Hz， 1H）， 7.17 - 7.09 （m， 1H）， 2.57 （t， J = 7.4 Hz， 2H）， 1.72 - 1.58 （m， 2H）， 1.46 - 1.15 （m， 16H）， 0.86 （t， J = 6.5 Hz， 3H），13C NMR （101 MHz， DMSO） δ 178.57， 172.18， 151.35， 141.57， 136.35， 130.17， 125.73， 123.65， 120.23， 33.94， 31.79， 29.49， 29.36， 29.20， 28.90， 24.77， 22.58， 14.42； ESI-MS m/z = 377.3 [M+H］+。

化合物3m：3-苯甲酰氧基苯甲醛缩胺基硫脲，白色固体，产率88%；m.p. 207.9～209.3； 1H NMR （400 MHz， DMSO-d6） δ 11.53 （s， 1H）， 8.26 （s， 1H）， 8.17 （s， 1H）， 8.16 - 8.11 （m， 2H）， 8.10 （s， 1H）， 7.92 （t， J = 1.9 Hz， 1H）， 7.80 - 7.73 （m， 1H）， 7.67 - 7.59 （m， 3H）， 7.50 （t， J = 7.9 Hz， 1H）， 7.35 - 7.29 （m， 1H），13C NMR （101 MHz， DMSO） δ 178.60， 165.06， 151.54， 141.49， 136.49， 134.58， 130.32， 130.27， 129.46， 129.30， 126.27， 123.80， 120.16； ESI-MS m/z = 299.4 [M+H］+。

化合物3n：3-苯乙酰氧基苯甲醛缩胺基硫脲，白色固体，产率86%；m.p. 131.1～132.0； 1H NMR （400 MHz， DMSO-d6） δ 11.50 （s， 1H）， 8.26 （s， 1H）， 8.10 （s， 1H）， 8.05 （s， 1H）， 7.69 （t， J = 2.0 Hz， 1H）， 7.63 （d， J = 7.7 Hz， 1H）， 7.48 - 7.27 （m， 6H）， 7.18 - 7.12 （m， 1H）， 3.99 （s， 2H），13C NMR （101 MHz， DMSO） δ 178.57， 170.53， 151.35， 141.61， 136.38， 134.22， 130.27， 130.02， 128.94， 127.53， 125.86， 123.58， 120.21， 40.55； ESIMS m/z = 313.1 [M+H］+。

2.2 化合物对酪氨酸酶抑制活性

我们分别测试了化合物3a - 3n对蘑菇酪氨酸酶的抑制活性，发现所合成的14种化合物中有12种对酪氨酸酶表现出较强的抑制效果，测试结果如表1所示。

表1 化合物3a - 3n对酪氨酸酶抑制的IC50值

测试结果显示，所合成的14种3-酯基苯甲醛缩氨基硫脲衍生物中有12种化合物对酪氨酸酶表现出极强的抑制活性，其中有9种化合物活性优于曲酸，8种化合物对酪氨酸酶的IC50值小于10 µM。由表1可以看出，当化合物中的羟基未被取代时，3-羟基苯甲醛缩氨基硫脲对酪氨酸酶的IC50值为3.9 µM[10］，在化合物中3-位引入酯基之后，化合物表现出的酪氨酸酶抑制活性获得提升，最高达到1.1 µM，但是随着引入的酯基链长逐渐增加，这类化合物对酪氨酸酶的抑制活性逐渐降低，由1.1 µM降低到大于 100 µM，可能是因为随着化合物碳链的增长，化合物在水溶液中的溶解度降低，使得化合物的活性降低；同时碳链的增长可能导致整个化合物被碳链包裹，导致化合物活性降低。与4-酯基取代苯甲醛缩氨基硫脲衍生物相比较[11］，3-位与4-位取代化合物对酪氨酸酶的抑制活性基本一致。

2.3 化合物3a的细胞毒性

通过CCK-8方法测试了这类化合物中活性最好的化合物3a的细胞毒性，测试结果表明，这一化合物对293T细胞不表现出任何毒性（如图3），这表明，这类化合物具备良好的应用价值。

图3 化合物3a对293T细胞毒性测试结果

我们以未加入化合物3a时的细胞增殖数为1，加入不同浓度的化合物3a，使其终浓度为31.25、62.5、125、250、500、1 000 µM，经过培养之后，我们发现化合物3a不会杀死293T细胞，同时不会抑制293T细胞的增殖，证明化合物3a对293T细胞不表现出任何毒性，这类化合物拥有一定的应用价值。

3 结论

本论文中，我们设计合成了14种3-酯基苯甲醛缩氨基硫脲衍生物，测试了这些化合物对酪氨酸酶的抑制作用，大多数这类化合物对酪氨酸酶表现出强烈的抑制效果。同时，缩氨基硫脲基团的存在是这类化合物表现出酪氨酸酶抑制活性的关键基团，在这类化合物中引入适当的亲脂性基团对这类化合物的活性提升具备积极作用。细胞毒性测试实验结果表明，这类化合物对细胞没有毒性，表明这类化合物具备了一定的应用价值。