拟康定乌头和林地乌头中二萜生物碱类化学成分研究

韩 萌 ，王腾飞，单连海，陈 琳 ，黄 帅 ，周先礼 *

1.西南交通大学生命科学与工程学院，四川 成都 610031

2.西南交通大学宜宾研究院，四川 宜宾 644004

毛茛科（Ranunculaceae）乌头属AconitumL.植物在全世界共有300余种，我国是该属植物资源最丰富的国家，大约有200种，主要分布于我国四川、云南、西藏及东北等地[1]。乌头属植物在我国药用历史上早有记载，常用于治疗风寒湿痹、关节疼痛、内分泌失调等疾病[2]。研究表明，二萜生物碱（diterpenoid alkaloids，DAs）是乌头属植物的特征性成分[3]，具有多种药理活性。其中，高乌甲素（lappaconitine）、草乌甲素（bulleyaconitine A）和3-乙酰乌头碱（3-acetylaconitine）已广泛应用于临床治疗各种疼痛[4]。因此，乌头属植物有巨大的研究研究价值。拟康定乌头A.rockiiFletcher et Lauener为毛茛科乌头属植物，主产于我国云南中甸，生于海拔3900～4100 m山地矮杜鹃灌丛中或灌丛边[5]，目前已经从该种植物中分离得到36个单体化合物，包括31个乌头碱型C19-二萜生物碱、2个7,17断裂型C19-二萜生物碱、1个海替生型C20-二萜生物碱、1个瓦那文型C20-二萜生物碱和1个双二萜型二萜生物碱，其中 ludaconitine、indaconitine、transconitine B和14-benzoylneoline表现出较好的拒食活性[6-8]。林地乌头A.nemorumPopov是毛茛科乌头属乌头亚属植物，分布于中国新疆地区以及哈萨克斯坦等地，生于海拔2060～3000 m山地草坡或云杉下[5]，其块根有剧毒，炮制后具有祛风散寒、止痛等功效[9-10]，目前已从该种植物中分离得到7个化合物，包括5个乌头碱型C19-二萜生物碱和2个呐哌啉型C20-二萜生物碱[11-12]。拟康定乌头和林地乌头为乌头属植物，均含有结构复杂、活性多样的特征性二萜生物碱，但目前对该2种植物化学成分研究都不够彻底，为了丰富乌头属植物的化学成分结构类型，为后续开展相关生物活性研究提供物质基础，因此本实验对这2种植物的化学成分进行了进一步研究，从拟康定乌头中分离鉴定了6个二萜生物碱，其中包括1个新的乌头碱型C19-二萜生物碱，命名为拟康定乌碱甲（rockiitine A，1），以及5个已知的二萜生物碱，分别为工布乌碱（kongboendine，2）、大渡乌碱（franchetine，3）、膝乌宁碱甲（genicunine A，4）、滇乌碱（yunaconitine，5）和黄乌生（vilmorisine，6），化合物2～6为首次从拟康定乌头中分离得到；从林地乌头中分离得到10个化合物，分别鉴定为塔拉萨敏（talatisamine，7）、14-乙酰塔拉萨敏（14-acetyltalatisamine，8）、卡马考宁（cammaconine，9）、16-epipyroaconine（10）、乌头碱（aconitine，11）、3-脱氧乌头碱（3-deoxyaconitine，12）、牛扁碱（lycoctonine，13）、甲基牛扁碱（methyllycaconitine，14）、德尔色明甲（delsemine A，15）、德尔色明乙（delsemine B，16）。其中，化合物9～16为首次从该植物中分离得到。

1 仪器与试药

FTIR-650傅里叶变换红外光谱仪（天津港东科技股份有限公司；Bruker AV 400，Bruker AV 600核磁共振仪（德国Bruker公司）；Acquity UPLC/Xevo G2-S TOF mass-超高效液-质联用仪（Waters）；岛津LCMS-8040；RE-2000A-旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；Perkin-Elmer 341-旋光光度计（Perkin-Elmer公司）、优普UPT-I-20L落地式纯水机（四川优普超纯科技有限公司）、ZF-20 C型紫外光谱仪、电子分析天平（托利多上海仪器有限公司）。薄层色谱硅胶GF254（青岛海洋化工厂）、硅胶H（青岛海洋化工厂）、碱性氧化铝（100～200目，天津致远化学试剂公司）和ODS-18反相硅胶（40～60µm，Merck公司）。

拟康定乌头于2018年8月采自云南丽江中甸县，经云南中医学院李国栋教授鉴定为拟康定乌头A.rockiiFletcher et Lauener，标本（2018HS0802）留存于西南交通大学生命科学与工程学院；林地乌头于2015年8月采自新疆乌鲁木齐后峡及伊犁阿合牙孜沟，由中国科学院植物华南园杨亲二研究员鉴定为林地乌头A.nemorumPopov，标本（C.Ren & L.Wang 825）保存于中国科学院华南植物园。

2 提取与分离

将拟康定乌头根块（10.9 kg）粉碎后，用95%乙醇冷浸5次，每次7 d，滤液减压浓缩得总浸膏1.0 kg，用温水溶解后加入稀盐酸调pH至2～3，用石油醚进行4次萃取，每次3.0 L，减压浓缩后得到石油醚部分。水溶液用氨水调pH至9～10，二氯甲烷萃取至无生物碱，减压浓缩萃取液，得到总生物碱150.0 g。采用正相硅胶柱色谱（石油醚-醋酸乙酯100∶1～0∶1梯度洗脱）将总生物碱分为6个部分A～F。对F部分进行硅胶柱色谱（二氯甲烷-甲醇90∶1～0∶1），进行梯度洗脱得6个部分F1～F6。F2部分通过硅胶柱色谱（石油醚-丙酮80∶1～1∶1+1%二乙胺），得到2个部分F2-1和F2-2；F2-2部分通过硅胶柱色谱（石油醚-丙酮50∶1～2∶1+1%二乙胺）得到化合物2（16.0 mg）和3（15.0 mg）；F3部分通过硅胶柱色谱（石油醚-丙酮60∶1～1∶1+1%二乙胺）得到化合物5（11.0 mg）；F4部分通过硅胶柱色谱（石油醚-丙酮50∶1～1∶1+1%二乙胺）得到3个部分F4-1～F4-3，F4-1经硅胶柱色谱（石油醚-醋酸乙酯50∶1～1∶1+1%二乙胺）得化合物6（20.3 mg）。F5部分通过硅胶柱色谱（石油醚-丙酮30∶1～1∶1+1%二乙胺）得到2个部分F5-1～F5-2，F5-1经反相柱色谱（甲醇-水5∶1）得到化合物1（9.0 mg），F6部分用硅胶柱色谱（二氯甲烷-甲醇70∶1～0∶1）得到3个部分F6-1～F6-3，F6-2部分用碱性氧化铝柱色谱（氯仿-甲醇18∶1），得到化合物4（13.0 mg）。

林地乌头（5.0 kg）提取方法同上，得到总生物碱6.6 g。生物总碱经硅胶柱色谱（二氯甲烷-甲醇1∶0～0∶1）得到3个部分I～III。I部分经反复硅胶柱色谱（石油醚-丙酮-二乙胺40∶1∶0.1～15∶1∶0.1）得到化合物10（5.0 mg）、11（10.0 mg）和12（6.0 mg）。II部分通过反复硅胶柱色谱（石油醚-丙酮-二乙胺10∶1∶0.1～5∶1∶0.1）得到8（220.0 mg）、7（160.0 mg），再经氧化铝柱色谱（氯仿-甲醇120∶1）得到化合物13（13.0 mg）。III部分通过反相硅胶柱色谱（甲醇-水25∶75～50∶50）得到化合物9（15.0 mg）、14（7.0 mg）、15和16（11.0 mg）。

3 结构鉴定

化合物1：白色无定形粉末，[α]20D+21.6°（c0.20，CHCl3），通过HR-ESI-MS推测其分子式为C33H47NO7（m/z570.351 8 [M+H]+，计算值570.353 7，C33H48NO7）。红外光谱表明该化合物结构中具有芳环（1603、1491、1451 cm−1）和酯羰基（1721 cm−1）。1H-和13C-NMR图谱显示该化合物结构中具有1个氮乙基 [δH1.08 (3H, t,J= 7.2 Hz), 2.46 (1H, m),2.50 (1H, m)；δC13.6 q, 49.1 t]，1个苯甲酰氧基 [δH7.52 (1H, t,J= 7.8 Hz), 7.42 (2H, t,J= 7.2 Hz), 8.07(2H, d,J= 7.2 Hz)；δC131.0 s, 132.6 d, 129.9 d×2,128.3 d×2, 166.7 s]，5个甲氧基 [δH3.13, 3.26, 3.30(各3H, s), 3.31 (6H, s)；δC48.5 q, 56.4×2 q, 58.7 q,59.3 q]。该化合物共有33个碳原子，除上述取代基团外，13C-NMR结合DEPT谱图可知剩余的19个碳信号中包含6个亚甲基（δC26.6, 35.0, 29.7, 35.5,80.4, 54.1）、10个次甲基（δC38.2, 45.2, 45.7, 48.6×2,61.3, 76.3, 83.2, 85.5, 83.4）和3个季碳（δC39.1, 50.8,78.5）（表1）。以上结构信息表明，化合物1是具有1个氮乙基、5个甲氧基和1个苯甲酰氧基取代的乌头碱型C19-二萜生物碱[13]。仔细分析HMBC图谱可知（图1），δH3.26, 3.31, 3.13 (各3H, s)分别与δC85.5 (d),δC83.3 (d),δC78.5(s) 存在远程相关，δH3.31 (6H, s) 与δC83.2 (d)、δC80.4 (t) 相关，证明5个甲氧基分别位于C-1、C-6、C-8、C-16和C-18位。进一步分析HMBC图谱，δH5.01 (1H, t,J= 4.8 Hz) 与酯羰基（δC166.7 s）、C-16（δC83.4 d）、C-8（δC78.5 s）有远程相关，证明苯甲酰氧基连接在C-14位。

图1 化合物1的结构及关键1H-1H COSY、HMBC (a) 和NOESY (b) 相关Fig.1 Key 1H-1H COSY, HMBC (a), NOESY (b) correlations of compound 1

表1 化合物1的核磁数据 (600/150 MHz, CDCl3)Table 1 NMR data of compound 1 (600/150 MHz, CDCl3)

化合物1的立体构型通过NOESY确定（图1）。Hβ-10与H-14、H-1，Hβ-9与H-6，Hα-17与H-16有远程相关，说明1-OCH3、6-OCH3与14-OBz为α型，16-OCH3为β型。因此，确定了化合物1的结构（图1），命名为拟康定乌碱甲（rockiitine A）。

化合物2：无色固体，分子式为C32H43NO7。HR-ESI-MSm/z: 554.371 3 [M+H]+。1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 8.01 (2H, d,J= 8.8 Hz, H-2′, 6′),6.91 (2H, d,J= 8.8 Hz, H-3′, 5′), 5.76 (1H, d,J= 5.6 Hz, H-7), 5.11 (1H, d,J= 4.8 Hz, H-14β), 3.25, 3.28,3.36, 3.85 (各3H, s, 4×OCH3), 1.01 (3H, t,J= 7.2 Hz,N-CH2CH3)；13C-NMR数据见表2。以上数据与文献报道一致[14]，故鉴定化合物2为kongboendine。

化合物3：无色固体，分子式为C31H41NO6。HR-ESI-MSm/z: 524.305 2 [M+H]+。1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 8.05 (2H, d,J= 8.2 Hz, H-2′, 6′),7.54 (1H, dd,J= 10.6, 4.4 Hz, H-4′), 7.43 (2H, t,J=7.8 Hz, H-3′, 5′), 5.77 (1H, d,J= 5.2 Hz, H-7), 5.14(1H, d,J= 4.8 Hz, H-14β), 4.40 (1H, d,J= 6.2 Hz,H-6), 3.24, 3.36, 3.28 (各3H, s, 3×OCH3), 1.01 (3H,t,J= 7.2 Hz,N-CH2CH3)；13C-NMR数据见表2。以上数据与文献报道基本一致[15]，故鉴定化合物3为franchetine。

化合物4：白色粉末, 分子式为C22H35NO4。HR-ESI-MSm/z: 378.463 7 [M+H]+。1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 1.07 (3H, t,J= 7.2 Hz,N-CH2CH3),3.28 (3H, s, OCH3), 3.85 (1H, d,J= 8.0 Hz, H-16α),4.25 (1H, t,J= 5.2 Hz, H-14β)；13C-NMR的数据见表2。以上数据与文献报道基本一致[16]，故鉴定化合物4为genicunine A。

化合物5：白色粉末，分子式为C35H49NO11。HR-ESI-MSm/z: 660.265 4 [M+H]+。1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 1.09 (3H, t,J= 7.2 Hz,N-CH2CH3),1.32 (3H, s, 8-OCOCH3), 3.14, 3.24, 3.28, 3.53, 3.85(各3H, s, 5×OMe), 4.86 (1H, d,J= 5.0 Hz, H-14β),6.92 (2H, d,J= 7.4 Hz, H-2′, 6′), 8.01 (2H, d,J= 7.4 Hz, H-3′, 5′)；13C-NMR数据见表2。上述数据与文献报道基本一致[17]，故鉴定化合物 5为yunaconitine。

化合物6：白色粉末，分子式为C26H39NO6。HR-ESI-MSm/z: 462.285 6 [M+H]+。1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 1.05 (3H, t,J= 7.2 Hz,N-CH2CH3),5.67 (1H, d,J= 6.0 Hz, H-7), 4.89 (1H, brs, H-14),3.26, 3.18和3.22 (3H, s, 3×OCH3)；13C-NMR数据见表2。上述数据与文献报道基本一致[15]，故鉴定化合物6为vilmorisine。

化合物7：白色粉末，分子式C24H39NO5。ESI-MSm/z: 422.29 [M+H]+。1H-NMR (600 MHz,CDCl3)δ: 1.06 (3H, t,J= 7.2 Hz,N-CH2CH3), 3.36,3.32, 3.28 (各 3H, s, 3×OMe), 2.07 (3H, s,14-OCOCH3)；13C-NMR的数据见表2。以上数据与文献报道基本一致[18]，故鉴定化合物 7为talatisamine。

化合物8：白色粉末，分子式C26H41NO6。ESI-MSm/z: 464.30 [M+H]+。1H-NMR (600 MHz,CDCl3)δ: 1.09 (3H, t,J= 7.2 Hz,N-CH2CH3), 3.31,3.30, 3.28 (各3H, s, 3×OCH3)；13C-NMR的数据见表2。以上数据与文献基本一致[19]，故鉴定化合物8为14-acetyltalatisamine。

表2 化合物2～8的13C-NMR数据 (100 MHz, CDCl3)Table 2 13C-NMR data of compounds 2—8 (100 MHz, CDCl3)

化合物9：白色粉末，分子式C23H37NO5。ESI-MSm/z: 408.27 [M+H]+。1H-NMR (600 MHz,CDCl3)δ: 1.09 (3H, t,J= 7.2 Hz,N-CH2CH3), 3.36,3.28 (各3H, s, 2×OMe）；13C-NMR的数据见表3。以上数据与文献报道一致[20]，故鉴定化合物9为cammaconine。

化合物10：白色粉末，分子式C25H39NO8。ESI-MSm/z: 482.27 [M+H]+。1H-NMR (600 MHz,CDCl3)δ: 1.06 (3H, t,J= 7.2 Hz,N-CH2CH3), 3.74,3.30, 3.28, 3.22 (各3H, s, 4×OMe)；13C-NMR的数据见表3。上述数据与文献报道基本一致[21]，故鉴定化合物10为16-epipyroaconine。

化合物11：白色粉末，分子式C34H47NO11。ESI-MSm/z: 646.32 [M+H]+。1H-NMR (600 MHz,CDCl3)δ: 1.10 (3H, t,J= 7.2 Hz,N-CH2CH3), 3.30,3.27, 3.17 (各3H, s, 3×OMe), 7.46 (2H, t,J= 7.2 Hz,H-3′, 5′), 7.57 (H, t,J= 7.2 Hz, H-4′), 8.03 (2H, d,J=7.2 Hz, H-2′, 6′)；13C-NMR的数据见表3。以上数据与文献报道一致[22]，故鉴定化合物11为aconitine。

表3 化合物9～16的13C-NMR数据 (150 MHz, CDCl3)Table 3 13C-NMR data of compounds 9—16 (150 MHz, CDCl3)

化合物12：白色粉末，分子式C34H47NO10。ESI-MSm/z: 630.32 [M+H]+。1H-NMR (600 MHz,CDCl3)δ: 1.07 (3H, t,J= 7.2 Hz,N-CH2CH3), 3.26,3.15 (各3H, s, 2×OMe), 7.45 (2H, t,J= 7.2 Hz, H-3′,5′), 7.56 (1H, t,J= 7.2 Hz, H-4′), 8.02 (2H, d,J= 7.2 Hz, H-2′, 6′)；13C-NMR的数据见表3。以上数据与文献报道一致[23]，故鉴定化合物 12为3-deoxyaconitine。

化合物13：白色粉末，分子式C25H41NO7。ESI-MSm/z: 468.29 [M+H]+。1H-NMR (600 MHz,CDCl3)δ: 1.09 (3H, t,J= 7.2 Hz,N-CH2CH3), 3.54,3.37, 3.26, 3.08 (各3H, s, 4×OMe)；13C-NMR的数据见表3。以上数据与文献报道基本一致[24]，故鉴定化合物13为lycoctonine。

化合物14：白色粉末，分子式C37H50N2O10。ESI-MSm/z: 683.35 [M+H]+。1H-NMR (600 MHz,CDCl3)δ: 1.10 (3H, t,J= 7.2 Hz,N-CH2CH3), 3.45,3.40, 3.36, 3.26 (各3H, s, 4×OMe)；13C-NMR的数据见表3。以上数据与文献报道基本一致[24]，故鉴定化合物14为methyllycaconitine。

化合物15和16：白色粉末，分子式C37H53N3O10。ESI-MSm/z: 700.38 [M+H]+；1H-NMR(600 MHz, CDCl3)δ: 1.08 (3H, t,J= 7.2 Hz, H-22),11.09/11.13 (1H, brs, NH), 8.65 (1H, m, H-3′), 7.95(1H, m, H-6′), 7.75 (1H, m, H-4′), 7.08 (1H, m, H-5′）；13C-NMR的数据见表3。以上数据与文献报道[25]相符，故鉴定化合物15和16为一对区域异构二萜生物碱的混合物，即delsemine A和B。

4 讨论

本研究从拟康定乌头和林地乌头中共分离鉴定16个化合物，包括1个新的乌头碱型C19-二萜生物碱和15个已知化合物（化合物2～16），包括3个7,17断裂型C19-二萜生物碱、9个乌头碱型C19-二萜生物碱和3个牛扁碱型C19-二萜生物碱，符合肖培根教授提出的显柱乌头系和准噶尔乌头系生物碱成分特征[26]。该研究进一步丰富了2种药用草乌的化学成分研究，为其植物化学分类提供了参考依据，也为后续开展相关生物活性研究提供了一定的物质基础。研究表明，C19-二萜生物碱通常具有抗肿瘤、抗炎和杀虫等生物活性[27-29]，因此后期拟对分离所得化合物进行相关活性测定，为天然产物的开发利用提供参考。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突