鳉鱼肠激酶在大肠埃希菌中的可溶性表达、纯化及活性鉴定

张五妮，刘玉林，朱秋媚，王江林，毕江坤，俞露，张宇

长春生物制品研究所有限责任公司细胞因子室，吉林 长春 130012

肠激酶（enterokinase，EK）是一种丝氨酸蛋白酶，普遍存在于脊椎动物十二指肠内［1-2］。EK 在肠中通过将胰蛋白酶原转化为胰蛋白酶来启动消化酶的活化［3］，可特异性识别 Asp-Asp-Asp-Asp-Lys 序列并切割该序列，经过EK 酶切获得的目的蛋白具有天然氮端氨基酸序列［4］。在基因工程领域，EK 是一种重要且常用的工具酶［5］。目前市售的EK 主要包括天然EK、重组人EK、重组牛EK 等。但获得天然EK 的成本较高［6］，因此通过使用基因工程技术来制备EK 成为一种重要手段。

研究发现，哺乳动物来源的EK 特异性较差［7］，往往酶切出非特异性酶切片段，从而导致产生副产物。OGIWARA 等［8］发现，鳉鱼来源的 EK 特异性明显高于哺乳动物来源的EK。鳉鱼EK 轻链具有完整的催化活性，相对分子质量为26 700，分子内有9个半胱氨酸残基，可形成4 对二硫键，且该酶的酶切条件较为广泛，在pH 4.5 ～ 9.5 及4 ～ 45 ℃均具有较好的酶切活性。

大肠埃希菌表达系统是常用的表达系统，该表达系统遗传背景清晰、简单，繁殖周期相对较短，培养方式简单，培养成本低，大大降低了生产EK 的成本［9］。但大肠埃希菌缺乏真核生物蛋白质的修饰加工系统［10］，且外源基因在大肠埃希菌表达常处于还原性的细胞质中，不易形成正确的二硫键，导致无生物活性的包涵体产生。本研究尝试使用融合标签技术，通过降低外源蛋白合成速率及改变培养条件等，在大肠埃希菌表达系统进行鳉鱼EK 的可溶表达。在可溶性标签与EK 之间加入EK 酶切位点，通过自酶切反应，制备高活性的EK。

1 材料与方法

1.1 细胞及质粒 TransB（DE3）化学感受态细胞、Trans1-T1 化学感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；含EK 序列的质粒由北京擎科新业生物技术有限公司合成；pGEX-4T-1 质粒由本公司细胞因子室保存。

1.2 主要试剂及仪器 含EK 识别序列的组氨酸标签生长激素（HisGH）由本公司细胞因子室保存；生长激素（growth hormone，GH）标准品购自中国食品药品检定研究院；重组牛EK 购自北京百华百汇生物科技有限公司；TransStart FastPfu DNA Polymerase、T4 DNA Ligase、5 K DNA marker、8 K DNA marker 购自北京全式金生物技术有限公司；YeaRed 核酸染料、还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）购自上海圣翊生物技术有限公司；AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒购自康宁生命科学（吴江）有限公司；质粒提取试剂盒购自康为世纪生物技术有限公司；Quickcut BamHⅠ、Quickcut XhoⅠ购自宝日医生物技术有限公司；谷胱甘肽转移酶（glutathione transferase，GST）亲和层析填料、Q Bestarose High Performance、BXK16 ／ 26 层析柱购自上海博格隆生物技术有限公司；1.5 mL 3 K 超滤管购自默克密理博公司；Human Growth Hor-mone Affinity Mahrix 层析填料购自赛默飞生物科技有限公司；AKTA Purifier100 购自美国GE 公司；电泳仪购自美国BIO-RAD 公司；高效液相色谱仪购自铂金艾尔默公司；液相色谱分析柱（TSKgel G2000-SW）购自东曹株式会社；超高效液相串联质谱仪购自美国Warters 公司。

1.3 鳉鱼EK 基因的扩增 从NCBI 中查找鳉鱼EK基因（100125449）设计并合成引物序列，FW：5′-CGGGATCCGACGACGACGACAAAGTGGTGGGCGGCGTGAACG-3′（下划线部分为BamHⅠ酶切位点），RV：5′-GGCTCGAGTTAATCCAGATCGCTAAAGCTG3CTGCGGCGGG-3（′下划线部分为XhoⅠ酶切位点），扩增片段大小为759 bp。引物由吉林省库美生物技术有限公司合成。以含有EK 序列的质粒为模板，利用引物FW、RV，使用TransStart FastPfu DNA Polyrrmease 高保真聚合酶对目的基因进行快速扩增。反应条件为：95 ℃ 10 min；95 ℃ 20 s，69 ℃ 20 s，72 ℃25 s，共35 个循环；72 ℃再延伸5 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳120 V，50 min 分离后，切胶回收。

1.4 重组表达质粒pGEX-EK 的构建 将切胶回收后的PCR 产物及pGEX-4T-1 质粒分别用Quickcut BamHⅠ和Quickcut XhoⅠ37 ℃水浴酶切15 min；经1%琼脂糖核酸电泳分离后，切胶回收，回收产物经T4 DNA Ligase 25 ℃快速连接15 min；连接产物转化至 Trans1-T1 化学感受态细胞中，37 ℃，220 r ／ min摇床培养 1 h；取转化产物涂布含 50 μg ／ mL 氨苄青霉素的平板，37 ℃恒温培养箱倒置过夜；挑取4 个单菌落，接种至含 50 μg ／ mL 氨苄青霉素的 5 mL LB培养基中，37 ℃摇床培养至A600为2.0 时，提取质粒，进行双酶切（Quickcut BamHⅠ／ Quickcut XhoⅠ）及1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定正确的质粒送长春库美生物技术有限公司测序。

1.5 最佳诱导条件的确定 将上述测序正确的重组体转化至 TransB（DE3）化学感受态细胞中，过夜培养；挑取单菌落至含50 μg ／ mL 氨苄青霉素的LB培养基，培养至A600约1.0 时，分组接种进行诱导条件试验，以诱导剂IPTG 浓度、诱导时A600及诱导温度为影响因素。按2%接种比例将菌种接种至含50 μg ／ mL 氨苄青霉素的 5 mL LB 培养基，37 ℃培养至A600分别为0.6 和1.2 时，开始诱导，IPTG浓度分别为 0.1 和 1.0 mmol／L，诱导温度设为 18 和 37 ℃，6 h 后，取样进行15% SDS-PAGE 鉴定。经凝胶成像系统分析各条带中目的蛋白含量。

1.6 目的蛋白的表达及纯化 取保存的甘油菌划线，挑取单个菌落接种至含50 μg ／ mL 氨苄青霉素的5 mL LB 培养基，过夜培养；按2%的接种比例接种至含 50 μg ／ mL 氨苄青霉素的 100 mL LB 培养基中，37 ℃培养；至 A600为1.0 时，按 2%的接种比例接种至含 50 μg ／ mL 氨苄青霉素的 1 000 mL LB 培养基中，37 ℃，220 r ／ min 培养；至菌液 A600为 0.6 ~0.7 时，加入 IPTG 至终浓度为 0.1 mmol ／ L，18 ℃培养 6 h；8 000 × g 离心 30 min；收集菌体沉淀，用菌体重量 10 倍体积的重悬液（140 mmol ／ L NaCl，2.7 mmol ／ L KCl，10 mmol ／ L Na2HPO4，1.8 mmol ／ L KH2PO）4重悬20 min；均质机均质，300 bar 1 次，800 bar 3 次；8 000 × g 离心 30 min；收集上清，用平衡液（140 mmol ／ L NaCl，2.7 mmol ／ L KCl，10 mmol ／ L Na2HPO4，1.8 mmol ／L KH2PO4，pH 7.4）以 100 cm ／ h的线性流速平衡10 个柱体积（column volume，CV）GST 亲和层析柱（BXK16 ／ 26，5 mL）后上样，平衡液淋洗 5 CV，洗脱液（50 mmol ／ L Tris-HCl，pH 7.4，10 mmol ／ L GSH）洗脱，收集洗脱主峰。GST 层析主峰经过室温过夜自酶切后进行Q Bestarose HP 层析（BXK16 ／ 26，5 mL）。用平衡液（20 mmol ／ L Tris-HCl，pH 8.0）以 3.3 mL ／min 流速平衡层析柱 10 CV后，将GST 主峰过夜酶切样品上样，以平衡液淋洗5 CV 后进行盐离子浓度梯度洗脱。洗脱方法为：100%平衡液→100%洗脱液（20 mmol ／ L Tris-HCl，pH 8.0，0.3 mol ／ L NaCl），10 CV。分峰收集样品进行HisGH 酶切试验，以确定EK 峰。收集的EK 峰经3 K 超滤管浓缩后，采用 Lowry 法检测浓度［11-12］，HPLC 法检测纯度［13-16］。

1.7 EK 活性分析 以HisGH 为底物，检测Q Bestarose HP 层析纯化获得的鳉鱼EK 比活性。将HisGH用 20 mmol ／ L Tris-HCl，pH 8.0 缓冲液稀释至终浓度1 mg／mL，将重组蛋白每1 mg 为1 份加至1.5 mL离心管中，再分别加入 1、10、20、30、40、50、60、70、80和 90 μL 鳉鱼 EK 及 1 mmol ／ L CaCl2、0.1% Tween-20，置37 ℃酶切16 h；酶切样品进行10% SDS-PAGE鉴定。酶切90%以上HisGH 的EK 最小用量（mg）的倒数即为酶的比活，按下式计算。

酶的比活（IU ／ mg）= 1 ／（浓度 × 最小用量 × 纯度）

1.8 EK 酶切特异性试验 分别用本研究的鳉鱼EK（20 mL 1 mg ／ mL HisGH，0.8 mL 0.23 mg ／ mL 鳉鱼EK，22 μL 1 mol／L CaCl）2和商品重组牛EK（20 mL 1 mg ／ mL HisGH，10 μL 重组牛 EK）酶切 HisGH，酶切产物首先进行Ni 柱层析，收集流穿液进行生长激素亲和层析（Human Growth Hormone Affinity Mahrix，BXK16 ／ 26，5 mL），以 GH 标准品为对照，收集主峰进行超高效液相串联质谱仪相对分子质量定性分析检测。

2 结 果

2.1 鳉鱼EK 基因扩增产物的鉴定 目的基因PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，可见759 bp 的条带，大小与理论值相符。见图1。

图1 EK 基因PCR 产物电泳图Fig.1 Electrophoretic profile of PCR product of EK gene

2.2 重组质粒pGEX-EK 的鉴定 质粒的的双酶切（BamHⅠ／ XhoⅠ）产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，可见4 984 和759 bp 的条带，大小与理论值相符。见图2。测序结果显示与目的基因序列相符。

图2 重组质粒pGEX-EK 的双酶切（BamHⅠ／XhoⅠ）鉴定Fig.2 Restriction map of recombinant plasmid pGEX-EK（BamHⅠ／ XhoⅠ）

2.3 最佳诱导条件 结果显示，37 和18 ℃培养条件下目的蛋白均有表达，且诱导剂浓度对蛋白表达量影响较小。A600为0.6 时诱导，目的蛋白表达量明显优于A600为1.2。见图3。确定最佳诱导条件为：诱导温度 18 ℃，A600为 0.6 时诱导，IPTG 浓度为0.1 mmol ／ L。

图3 不同诱导条件下重组蛋白的表达情况Fig.3 Expression of recombinant protein under various conditions for induction

2.4 表达及纯化产物的鉴定 结果显示，37 ℃培养条件下，GST-EK 蛋白均存在于均质后离心沉淀中，上清中无可溶性目的蛋白，经GST 层析，主峰中未见目的蛋白。18 ℃培养条件下，均质后离心上清及沉淀中均含有目的蛋白，经GST 层析，主峰中含有较多目的蛋白。见图4 ~ 图6。18 ℃培养条件下的菌体经破碎离心后进行GST 层析，GST 层析主峰经过夜自酶切后进行Q Bestarose HP 层析，纯化图谱显示，Q Bestarose HP 层析出现5 个主峰，见图7。Q Bestarose HP 层析各成分经15% SDS-PAGE 分析可见，峰1 ~ 3 蛋白浓度较低，峰4 ~ 5 蛋白浓度较高。见图8。

图4 18、37 ℃发酵菌体GST 层析图Fig.4 GST chromatogram of fermentation supernatant at 18 and 37 ℃

图6 37 ℃诱导后GST 层析产物的SDS-PAGE 分析Fig.6 SDS-PAGE profile of expressed protein induced at 37 ℃after purification by GST chromatography

图7 Q Bestarose HP 层析图谱Fig.7 Q Bestarose HP chromatographic profile

图8 Q Bestarose HP 层析产物的SDS-PAGE 分析Fig.8 SDS-PAGE profile of protein purified by Q Bestarose HP chromatography

收集Q Bestarose HP 层析下样进行酶切HisGH试验，结果显示，主峰3 ~ 5 均具有酶切活性，但主峰3 蛋白浓度较低却有较高的酶切活性。见图9。确定主峰3 为EK 峰。

图9 Q Bestarose HP 各主峰酶切HisGH 试验Fig.9 Enzyme digestion HisGH test on various main peaks on Q Bestarose HP chromatographic profile

Q Bestarose HP 主峰3 超滤浓缩后蛋白浓度为278 μg ／ mL。见图 10。

图10 Lowry 法标准曲线图Fig.10 Standard curve of Lowry method

2.5 鳉鱼EK 酶切活性 结果显示，酶切90%以上HisGH 的 EK 最小用量为 90 μL，见图 11。EK 纯度为86.8%，见图12。确定酶的比活为46 IU ／ mg。

图5 18 ℃诱导后GST 层析产物的SDS-PAGE 分析Fig.5 SDS-PAGE profile of expressed protein induced at 18 ℃after purification by GST chromatography

图11 酶切活性鉴定Fig.11 Identification of enzyme digestion activity

图12 EK 纯度的HPLC 法检测Fig.12 Determination of purity of EK by HPLC

2.6 鳉鱼EK 酶切特异性 结果显示，重组牛EK 酶切出非特异性片段（相对分子质量21 468.0），重组鳉鱼EK 未见非特异酶切片段，且与对照品相符（相对分子质量22 125.0）。见图13。

图13 酶切产物质谱相对分子质量分析Fig.13 Analysis of relative molecular mass of enzyme digested products

3 讨 论

有研究显示，鳉鱼EK 的酶切专一性明显高于哺乳动物来源的EK 的酶切专一性，是近几年克隆出的比较特殊的EK，被公认为具有较大发展潜力的基因工程工具酶［2］。但与天然EK 相比，鳉鱼EK 的活性较低。

本研究利用融合标签技术［17-20］，成功构建了pGEX-EK 表达质粒，转化至TansB 表达菌株后经过培养发酵获得GST-EK 融合蛋白。不同表达条件的电泳结果显示，IPTG 浓度对表达结果无明显影响。可能由于IPTG 作为一种作用极强的诱导剂且不易被细菌代谢，低浓度下即可诱导蛋白表达，过量存在的IPTG 对蛋白表达水平影响不大［21-22］。

诱导A600为0.6 时，目的蛋白表达量明显优于诱导A600为1.2 时。可能由于诱导菌体密度较大时，细菌处于指数生长后期或平台期，细菌内酶活性降低，导致蛋白表达水平降低［22］。因此，选择诱导A600=0.6 作为后续试验的表达条件之一。

由不同发酵温度条件获得的菌体经纯化后发现，37 ℃培养的菌体表达后均质上清无目的条带，18 ℃培养的菌体表达后均质上清有目的条带，两种条件下均质后离心沉淀均有目的条带。可能是由于37 ℃条件下蛋白合成速度较快，引起蛋白大量聚集从而形成包涵体，18 ℃条件下蛋白合成速度较慢，有利于所表达蛋白的胞内可溶。也可能由于目的蛋白溶解性及促溶标签的因素，即使在较低的蛋白表达速度下仍有部分蛋白形成包涵体［23］。

GST 亲和层析电泳结果显示，洗脱主峰电泳结果存在2 条主带，相对分子质量分别为27 600 和54 000，符合GST-EK（理论相对分子质量54 150）酶切产物GST（理论相对分子质量27 430）和EK（理论相对分子质量26 720）的相对分子质量。菌体电泳结果显示，在菌体收获阶段仅存在GST-EK。因此GST-EK 自酶切是发生在菌体破碎过程中，酶切产物为GST 和EK。对于本研究，期望自酶切反应发生在GST 层析后，因此在菌体破碎阶段通过向缓冲液中添加NaCl 抑制自酶切反应［24-26］。

GST 层析洗脱主峰经自酶切后进行Q Bestarose HP 层析，洗脱产物经酶切鉴定，确定洗脱峰3、4 和5 具有酶切活性且活性依次降低，确定洗脱峰3 为EK。其中，洗脱峰4 和5 具有酶切活性可能是由于Q Bestarose HP 层析未完全分离EK 与GST，导致洗脱峰4 和5 含有少量EK。

本实验室在对重组HisGH 的研究中发现，重组牛EK 酶切HisGH 时除DDDDK 位点外存在非特性酶切（相关数据未发表）。本研究通过对比重组鳉鱼EK 和重组牛EK 以HisGH 为底物的酶切产物，评价两种酶的酶切特异性。酶切产物经Ni 亲和层析，去除HisGH 及His 标签，收集的流穿液中含有EK、GH及其他酶切产物。将该流穿液上样GH 亲和层析，洗脱样品含有GH 及其他酶切产物。该GH 亲和层析介质的GH 亲和配体是骆驼源单结构域抗体片段，可特异性结合GH 抗原位点。因此可用于捕获完整GH 或GH 片段。通过对亲和层析洗脱样品的质谱分析发现，重组牛EK 的酶切产物有多种不同的相对分子质量，重组鳉鱼EK 的酶切产物具有单一相对分子质量且与对照品一致。因此，鳉鱼EK 具有更高的特异性。

综上所述，本研究通过大肠埃希菌表达系统以及融合标签技术成功实现了鳉鱼EK 的可溶性表达及纯化。该鳉鱼EK 经鉴定较重组牛EK 具有更高的特异性，具有较高的应用价值。