lncRNA-ATB介导的上皮间质转化在胃癌进展中的机制研究

智亮辉 刘伟 李伟 甄四虎 焦喜林

在我国，胃癌是第三大高发恶性肿瘤，早期诊断率低，超过70%的患者初诊时已处于进展期[1]，肿瘤发生局部侵袭和远处转移是其特有的生物学行为，也是导致患者死亡率升高的主要原因。上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指上皮细胞在特定的生理和病理情况下向间质细胞转化的现象，是肿瘤发生浸润、转移的重要机制[2]。虽然目前包括手术、放疗、化疗和生物治疗等胃癌的综合治疗手段有很大提高，但总体5年生存率仍低于20%[3-4]。因此探寻新的胃癌早期诊治标志物及新的治疗靶点、阻断其侵袭转移进程，对于延长胃癌患者的生存时间具有重大意义。

长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一类保守性差、组织特异性强，长度超过200个核苷酸的RNA序列[5]。国内外研究表明lncRNA在多种恶性肿瘤中高表达，对肿瘤侵袭转移等生物学行为发挥重要的调控作用[6]。其中lncRNA-ATB在肝癌、结肠癌、肺癌等肿瘤中均存在异常表达，并可做为诊断的生物标志物，及潜在的生物治疗靶点[7]，但其在胃癌中的作用及具体调控机制尚待研究。微RNA(miRNA)是一类长度约22个核苷酸的非编码RNA，可以作用于目的基因的3′非翻译区(3′-untranslated region，3′-UTR)，诱发蛋白质翻译抑制，阻止蛋白质合成，从而在细胞生物活动中发挥重要的调控作用[8]。近年来许多研究表明，miR-200家族参与调控多种肿瘤细胞的侵袭和转移过程，其中miR-200a的表达与胃癌的侵袭和转移密切相关[9]，但其具体机制尚待研究。本研究预测了lncRNA-ATB的下游结合分子，并探索其可能的作用机制。

1 资料和方法

1.1 一般资料

选取联勤保障部队第九八〇医院2017年1月—2019年12月行胃癌根治性手术患者56例，其中女性36例，男性20例；年龄45～75岁，中位年龄58岁。纳入研究标准：术前未进行过放化疗的Ⅰ～Ⅳ期原发性胃癌患者，术前有胃镜病理结果明确诊断。癌旁组织定义为距肿瘤边缘5 cm以上的组织。所有临床组织标本及病历资料的使用，均与患者签署知情同意书，并经医院伦理委员会批准同意(伦理批号：2019-KY-54)。

1.2 主要试剂和材料

RNA提取及反转录试剂盒分别购自美国Thermo Fisher公司、日本TaKaRa公司；荧光实时定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)试剂盒SYBRPremix Ex Taq TMⅡ购自日本TaKaRa公司；Lipo 2000脂质体转染试剂盒购自美国Invitrogen公司；lncRNA-ATB或β-catenin-3′UTR si序列克隆购自美国Creative Biogene公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司；人胃癌BGC-823细胞株购自中国科学院上海细胞库；胎牛血清、RPMI-1640培养基、0.25%胰酶、Penicillin-Streptomycin双抗购自美国Hyclon公司；RIPA高效蛋白裂解液购自美国Sigma公司；BCA蛋白浓度检测试剂盒购自美国Bio-Rad公司；E-cadherin、β-catenin、vimentin和GAPDH抗体购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 lncRNA靶基因预测及验证 使用TargetSCan数据库预测lncRNA-ATB的靶基因作用序列(http：//www.targetscan.org/vert_72/)，利用荧光素酶报告基因技术验证预测内容。miR-200a-modified胃癌细胞接种于6孔板，经过18h培养后，每孔加入1 μg荧光素酶转染试剂进行转染。用双荧光素酶报告基因检测试剂盒测定荧光素酶表达量。

1.3.2 qRT-PCR 收集离体半小时内胃癌及癌旁组织于冻存管中，迅速置于液氮中冻存。RNA提取及反转录试剂盒按照说明操作，最终得到cDNA置于-20℃保存备用。qRT-PCR按照说明书进行实验，共重复3次。lncRNA-ATB引物序列：上游5-CTTCACCAGCACCCAGAGA-3；下游5-AAGACAGAAAAACAGTTCCGAGTC-3；内参GAPDH引物序列：上游5-TTGGTATCGTGGAAGGACTC-3；下游5-TGTCATCATATTTGGCAGGTT-3；miR-200a特异性引物由德国凯杰公司合成，引物序列：上游5-ATCCAGTGCAGGGTCCCGAGG-3，下游引物为miScript SYBR Green PCR Kit 提供的通用引物，qRT-PCR 反应条件为：95℃预变性45 s，75℃15 s，60℃30 s，35个循环，每组3个复孔，实验重复3次。记录各组反应的CT值，以2-△△CT表示目的基因的相对表达量。

1.3.3 细胞培养及转染 人胃癌BGC-823细胞株及敲低lncRNA-ATB后的人胃癌BGC-823细胞株(课题组前期已构建并验证)在含10%胎牛血清的RPMI-1640细胞培养基中进行培养，培养条件为5% CO2、37℃。

1.3.4 Western blot实验 取生长状态良好且处于对数生长期的人胃癌BGC-823细胞及敲低lncRNA-ATB后的人胃癌BGC-823细胞株，用无菌的PBS清洗细胞2遍，用胰酶消化处理细胞，3 000 rpm离心5 min，弃去上清，在细胞沉淀中加入适量RIPA快速细胞裂解缓冲液提取细胞总蛋白，冰浴15 min，混合液在4℃离心15 min(13 000 r/min)后收取上清液，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定提取液浓度，再向提取裂解液中加入5×SDS上样缓冲液以备电泳，95℃加热5 min，并在SDS聚丙烯酰胺凝胶上进行蛋白电泳，将目的条带转移到PVDF膜上。然后加一抗(兔抗E-cadherin、β-catenin、vimentin抗体，稀释比分别为1∶200、1∶300、1∶200)4℃摇床过夜，第二天，去除一抗，PBS清洗2遍，每次10 min，再加入羊抗兔IgG HRP二抗(稀释比为1∶1 0000)，常温避光摇床孵育2 h，将荧光ECL检测试剂中的A液和B液等体积混合配成显影液，滴加到PVDF膜上，使用LAS4010仪器进行曝光。实验重复5次。GADPH作为内参对照。应用Image J软件进行半定量分析。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 生物信息学预测lncRNA-ATB与miR-200a及β-catenin的结合位点

lncRNA-ATB通过竞争性结合miR-200a调控β-catenin的表达(图1)。利用荧光素酶报告基因技术验证在胃癌细胞BGC-823中敲低lncRNA-ATB，miR-200a荧光素酶活性较敲低前表达明显下降，差异有统计学意义(t=75.262，P<0.001)(图2)。敲低β-catenin后，miR-200a荧光素酶活性较敲低前表达明显下降，差异有统计学意义(t=47.656，P<0.001)(图3)。

图1 生物信息学预测lncRNA-ATB与miR-200a及β-catenin的结合位点Figure 1 Bioinformatics prediction of binding sites for lncRNA-ATB and miR-200a and β-catenin

图2 在BGC-823细胞中转染sh-lncRNA-ATB序列后测定miR-200a荧光素酶活性Figure 2 Determination of miR-200a luciferase activity after transfection of sh-lncRNA-ATB in BGC-823 cellsNote：***P<0.001.

图3 在BGC-823细胞中转染sh-β-catenin-3′UTR后测定miR-200a荧光素酶活性Figure 3 Determination of miR-200a luciferase activity after transfection of sh-β-catenin- 3′UTR in BGC-823 cellsNote：***P<0.001.

2.2 胃癌及癌旁组织中lncRNA-ATB和miR-200a表达水平比较

lncRNA-ATB在胃癌组织中的表达水平高于癌旁组织，差异有统计学意义(t=-15.825，P<0.001)(图4)。miR-200a在胃癌组织中的表达水平低于癌旁组织，差异有统计学意义(t=11.629，P<0.001)(图5)。

图4 lncRNA-ATB在胃癌及癌旁组织中的表达水平Figure 4 Expression of lncRNA-ATB in gastric cancer and para-cancer tissuesNote：***P<0.001.

图5 miR-200a在胃癌及癌旁组织中的表达水平Figure 5 Expression of miR-200a in gastric cancer and adjacent tissuesNote：***P<0.001.

2.3 胃癌组织中lncRNA-ATB与miR-200a的表达水平相关性分析

在胃癌组织中lncRNA-ATB与miR-200a表达水平呈负相关(r=-0.317，P=0.017)(图6)。

图6 胃癌组织中lncRNA-ATB和miR-200a表达相关性Figure 6 Correlation between lncRNA-ATB and miR-200a expression in gastric cancer

2.4 胃癌组织中lncRNA-ATB及miR-200a的表达与临床病理特征的关系

胃癌组织中lncRNA-ATB及miR-200a表达水平与淋巴结转移、TNM分期分化程度、脉管内有无癌栓有关(P<0.05)，而与患者性别、年龄无关(P>0.05)(表1)。

2.5 敲降lncRNA-ATB后EMT相关指标的变化

在胃癌细胞BGC-823中敲降lncRNA-ATB后，vimentin(t=9.032，P=0.011)及β-catenin表达量(t=25.117，P<0.001)降低，E-cadherin表达量(t=-14.697，P<0.001)升高，差异具有统计学意义(图7)。

图7 在胃癌细胞BGC-823中敲降lncRNA-ATB后vimentin、β-catenin、E-cadherin表达水平Figure 7 Expression levels of vimentin，β-catenin and E-cadherin after knockdown of lncRNA-ATB in gastric cancer cell BGC-823Note：*P<0.05，***P<0.001.

表1 胃癌组织中lncRNA-ATB和miR-200a表达水平与临床病理特征的关系Table 1 Relationship between lncRNA-ATB and miR-200a expression levels and clinicopathological features in gastric cancer

3 讨论

侵袭和转移过程一般是指恶性肿瘤细胞与细胞外基质松解脱离，经过淋巴或血运等途径到达身体其它部位或器官并形成定植的过程。该过程是一个多阶段、多步骤的过程，多个基因及其产物参与调控[10]。EMT以上皮细胞表型丧失，间质特征获得为主要特征，在组织纤维化及肿瘤的侵袭和转移过程中发挥重要作用。在该过程中肿瘤细胞失去极性和细胞间连结，转变成具有运动能力的间质细胞，可通过局部浸润或脉管系统到达远隔组织[11]。E-cadherin是上皮细胞的标志性蛋白，担负上皮细胞间黏附和连接作用，维持上皮细胞的形态、极性及完整性。当E-cadherin表达下调时，上皮细胞间黏附力减弱，促进EMT的发生[12]。

近年研究发现miRNA在调控肿瘤生物学行为方面发挥重要作用[13]。miRNA是一种由内源基因编码的长度约22个核苷酸的非编码RNA，其特异性碱基序列可与目的基因3′-UTR特异性结合，导致目的基因降解或诱发蛋白质翻译抑制，从而发挥负调节的作用，进而影响细胞的分化及存活[14]。近年许多研究表明，miR-200家族参与调控了多种肿瘤细胞的侵袭和转移过程，对于miR-200的研究逐渐深入[15-16]。miR-200是一种与EMT密切相关的miRNA家族，其家族成员包括miR-141、miR-429、miR-200a、miR-200b和miR-200c，其中miR-200a可通过直接作用于E-cadherin的转录抑制因子β-catenin而调控EMT的进程[17-18]。

有研究表明lncRNA-ATB在多种恶性肿瘤的发生发展中发挥重要的调控作用，广泛参与了恶性肿瘤细胞的进展过程[19]，其在结直肠癌和肝癌的发展进程中的作用已经得到证实[20-21]。但lncRNA-ATB在胃癌中的具体作用机制尚无研究报道。生物信息学分析发现，lncRNA-ATB与miR-200a、miR-200a与β-catenin有直接的结合位点。

本研究采用生物信息学方法预测lncRNA-ATB与miR-200a及β-catenin可以直接结合，在胃癌细胞BGC-823中，采用荧光素酶报告实验证实，敲降β-catenin的3′-UTR后，miR-200a的表达水平显著降低。敲降lncRNA-ATB后，miR-200a的表达水平显著降低，这些结果进一步验证了上述推断。采用qRT-PCR方法检测了胃癌及癌旁组织中lncRNA-ATB和miR-200a 的表达水平，lncRNA-ATB和miR-200a表达的相关性分析提示，lncRNA-ATB对miR-200a表达具有明确的负调控作用。分析了这两种RNA与胃癌患者临床病理特征之间的关系，结果显示，lncRNA-ATB在胃癌组织中较癌旁组织呈高表达状态，在Ⅲ、Ⅳ期胃癌较Ⅰ、Ⅱ期表达水平明显升高，淋巴结转移阳性组较阴性组lncRNA-ATB表达水平明显升高。miR-200a在胃癌组织中较癌旁组织呈低表达状态，在Ⅲ、Ⅳ期胃癌较Ⅰ、Ⅱ期表达水平明显降低，淋巴结转移阳性组较阴性组miR-200a表达水平明显降低。在胃癌细胞中敲降lncRNA-ATB后，E-cadherin表达升高，β-catenin和vimentin表达下降，研究证实lncRNA-ATB通过与miR-200a结合促进了胃癌细胞EMT进程。在胃癌进展阶段发挥关键作用。

综上所述，本研究检测了lncRNA-ATB和miR-200a在胃癌组织及癌旁组织中表达，并验证了二者呈负相关，探索了lncRNA-ATB可能通过与miR-200a结合，调控EMT过程从而促进胃癌的发生发展，为研究胃癌侵袭转移潜在的分子机制提供了一定的前期研究基础。