多肽药物合成和纯化方法发展现状

高云龙

（哈尔滨吉象隆生物技术有限公司 黑龙江 哈尔滨 150025）

多肽是有一定活性的由氨基酸缩合连接而成的化合物分子，肽类具有很多重要的生物活性，参与机体的多种生理活动，在人体中发挥抗菌、抗氧化、降血脂等作用，在医药、农业等领域均有广泛作用。多肽药物是指具有特定治疗作用的多肽，应用于抗肿瘤、抗菌、疫苗、心血管、内分泌等方面。与小分子药物及蛋白质药物相比，多肽药物具有较易合成、低毒性、原料易得、产业化优势明显的独特优势，目前已成为药物开发的新趋势，具有重要的经济价值和社会价值。多肽的合成和纯化方法已然成为多肽药物研究的重点，本文就目前多肽制备工艺进行简要概述。

1.多肽合成方法

多肽合成发展迅速，目前多肽合成方法可分为化学合成方法和生物合成方法。化学合成方法主要包括液相合成法和固相合成法，生物合成方法主要包括天然提取法、发酵法、酶解法、基因重组法。

1.1 化学合成方法

多肽化学合成法利用保护基团保护原料氨基酸中暂时不反应的基团，保证反应按照设计方向进行，通过氨基酸之间的缩合反应来实现氨基酸连接延长，以获得特定序列的多肽。主要步骤包括保护、激活、缩合、去保护。液相合成法与固相合成法主要的区别源于是否使用固相载体。

1.1.1 液相合成法 液相合成法最早由Fischer 等创造出来，是第一个发展起来的肽合成法，包括逐步偶联和片段缩合。从肽链的碳端（C 端）氨基酸向氮端（N端）偶联氨基酸延长肽链即为逐步偶联，而片段缩合是先合成完整肽链中的部分短的肽链，再将各个短的肽链进行缩合成目标肽链。液相合成法的优点是保护基选择多、成本低，可以合成10 个氨基酸以下纯度较高的寡肽，缺点是每步进行耦合之后都需要纯化中间体，只适合合成寡肽，而且C 端氨基酸在溶液中易消旋。

1.1.2 固相合成法 1963 年，Merrifield 首先建立了固相合成的方法，是将C 端第一个氨基酸的羧基与固相载体即不溶性载体树脂相连，在缩合剂作用下与下一个被保护的氨基酸的羧基连接，重复操作，从肽链的C 端到N 端依次合成，直至多肽链完成，然后将多肽链从树脂上裂解，再经过分离纯化得到目标产物。固相合成法又分为Boc 固相合成法（α-氨基用叔丁氧羰基保护）和Fmoc 固相合成法（α-氨基用9-芴甲氧羰基保护）。与液相合成法相比，该方法适用于生产各种长度的多肽尤其是中长肽，每步中间体无需纯化，易于实现自动化处理，产品纯度和收率较高，在目前已有的多肽合成方法中固相合成方法相对成熟且应用较多，多数多肽药物是通过此方法制备。但是循环反应会产生大量的废液，而且氨基酸需要过量会导致原料浪费。

1.2 生物合成法

生物合成法可分为天然提取法、微生物发酵法、酶解法、基因工程表达法等，概述如下。

1.2.1 天然提取法 天然提取法是根据多肽分子量、电学性质等特性，通过物理、化学方法从生物组织中提取目标多肽的方法。天然提取法天然原料有限，分离过程影响因素多（包括天然原料的多肽种类和含量），经济价值不高，临床中患者可能产生过敏，此外部分物理化学法可能会导致多肽降解或影响后续研究。

1.2.2 微生物发酵法 微生物发酵法是利用微生物在生产代谢过程中产生酶来水解底物蛋白制备多肽的方法。目前，用于制备具有生物活性多肽的菌种主要有曲霉菌、乳酸菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等。微生物发酵法制备的具有生物活性的多肽有高活性酪蛋白血管紧张素转化酶抑制肽（AEC 抑制肽）、抗氧化活性肽、抗菌肽、免疫活性肽等，其中AEC 抑制肽是临床上常用的降血压药物。发酵法生产成本低、原料易得、适合工业化生产，但基础研究较差，生产技术不完善，生产过程中蛋白质利用率低，造成资源浪费和环境污染。该方法可以直接生产的多肽药物仍然较少，目前多应用于食品、化妆品、饲料等行业。

1.2.3 酶解法 酶解法是利用蛋白酶水解蛋白质得到目标多肽的方法，需要选择特定蛋白酶。酶解法具有反应特异性高、反应环境温和等优点，不足之处在于得到的多肽分离纯化难度大、产量低、耗费底物、质量控制难度较大。于丽娜采用Alcalase AF 2.4 L 碱性蛋白酶酶解提取鹿茸蛋白多肽，最佳工艺为：在温度55 ℃，pH7.5 条件下，以底物浓度为2%（m/v），加入8%（v/m）的酶反应2 h，多肽含量为36.28%。利用酶解法进行蛋白质深加工提供了一个可能的提高蛋白质利用率的思路，这种方法是否能够产业化则需要进一步提高产率。

1.2.4 基因工程表达法 随着基因工程技术的发展，实现了将基因片段转移到原核或真核细胞内容易被中进行基因表达的技术，并利用这种技术生产目标多肽。由于短肽在微生物酶降解，所以基因工程表达法适用于长炼肽的制备。该方法表达定向性强、成本低，但是基因表达研发困难、研发周期长、产率低、分离纯化难度大。温敏类弹性蛋白多肽是新型的药物载体，在肿瘤治疗中拥有广阔的应用前景，任艳艳等根据大肠杆菌密码子的简并性和偏好性，将高度连续重复氨基酸的多种遗传密码引入基因序列中，利用依次插入单体基因和递归定向连接技术，构建了以缬氨酸为客座氨基酸的ELPs基因的表达质粒库，即pET28-ELP-V～pET28-ELP-V。将pET28-V转化至表达宿主Escherichia coli BL21（DE3）中，经重组菌的培养和IPTG 诱导，结果显示ELP-V50 在大肠杆菌中成功获得了可溶性表达，与预期分子量大小一致。

2.多肽分离纯化方法

通过各种合成方法合成的多肽并非单一物质，而是目标多肽和极性相近多肽的混合物，为了得到目标多肽，需要进行分离纯化。根据多肽极性、所带电荷、分子量、大小、性状等选择不同的纯化方法。目前有多种多肽分离纯化方法，本文只简述常用的反相高效液相色谱法、离子交换色谱法、凝胶过滤色谱法、电泳法、亲和层析法、超滤法以及电渗析法。

2.1 反相高效液相色谱法

反相高效液相色谱法由极性流动相与非极性固定相组成，利用多肽分子的极性差异以及极性较弱的多肽分子与非极性固定相的结合进行梯度洗脱分离。该方法分离效果好、灵敏度高、易于实现自动化，且有些填料可以重复利用，虽然生产成本较高，但这并不影响反相高效液相色谱法成为工业生产中多肽分离纯化的首选方法。蒋雨晴等以卵白蛋白为原料，采用超滤法、凝胶色谱法、反相高效液相色谱法制备具有抑菌活性的蛋白肽，分离得到9 个组分抑菌活性，发现C3 组分的抑菌活性最高。付玉清等采用Fmoc 固相合成法，以Wang 树脂为载体，并且以HOBt/DIC 为缩合剂，逐步缩合获得利那洛肽线性肽树脂后，采用固相-裂解-液相结合的方式完成环化获得粗品。粗品经反相高效液相色谱法纯化后得到目标产物即精肽纯度高达99.32%。此种方法可以大规模制备利那洛肽，为工业化生产提供借鉴。

2.2 离子交换色谱法

离子交换色谱法是多肽阳离子或阴离子和固定相通过静电作用结合，然后以不同pH 值或不同离子强度的洗脱液洗脱，通过所带电荷差异对多肽进行分离。根据离子交换柱的不同，可分为阳离子交换色谱和阴离子交换色谱。离子交换色谱法进样量大、耐酸碱、分辨率高、操作简便，但是耗材贵、速度慢，并且需要选取合适的离子交换柱和洗脱条件。舒一梅以猪股骨酶解的酶解液为原料分离纯化猪股骨降血压肽，酶解液经超滤、凝胶层析初步分离后，采用离子交换层析对凝胶层析分离后的高活性组分进一步分离，从而得到纯度更高的降血压肽。通过对洗脱液离子强度、pH 值、流速三个因素进行研究，确定了最佳分离条件。结果显示离子交换层析分离得3 个组分中组分1 的活性最高，其IC50 值为0.1 012 mg/mL。

2.3 凝胶过滤色谱法

凝胶过滤色谱法以网状结构凝胶对不同大小和形状的多肽分子进行分离。凝胶具有分子筛作用，因粒径不同、移动路线、洗脱时间不同而分离。凝胶色谱法分离条件温和（产物不容易变性）、分离效果好，但是一般需要结合其他分离法才会得到较高纯度的多肽。Yu 等采用凝胶过滤层析、超滤、反相高效液相色谱等方法从螺旋藻酶解物中分离抗氧化肽。

2.4 电泳法

电泳法是多肽在电场作用下，根据分子量和所带电荷不同而被分离的方法。应用于多肽分离的电泳法有双向电泳法、聚丙烯酰胺电泳法、凝胶电泳法等，尤其是毛细管电泳法在多肽分离纯化方法得到了广泛应用。电泳法选择性强、分离效果好、分离速度快，但也可能使多肽丧失有效活性。张崟等对骨素蛋白酶解液采用N-三（羟甲基）甲基甘氨酸凝胶电泳法分离，能有效分离骨素酶解液中的肽。

2.5 亲和层析法

亲和层析法是一种利用固定相与多肽特异性结合（这种结合是可逆的）而纯化目的肽的方法。该方法优点在于分辨率高、特异性强、填料可重复使用，针对活性不稳定的多肽分离效果好，但是其适用范围小，主要用于抗体及糖蛋白的纯化。刘琳利用纤维连接蛋白与胶原蛋白具有亲和作用的原理，用乙醇沉淀明胶获得大分子蛋白，胰蛋白酶酶解后的产物经纤维连接蛋白亲和层析分离，获得了部分可与纤维连接蛋白特异性结合的明胶多肽。

2.6 超滤法

超滤法是通过膜表面的微孔结构对分子量在1 ～500之间的多肽进行选择性分离，主要是利用膜两端的压差截留多肽。超滤法操作简单、节约资源、不破坏多肽活性，但该方法只适用于初步分离，不适用于分离某种特定多肽。

2.7 电渗析法

电渗析在超滤的基础上改变分离多肽驱动力，引用阴阳离子膜，根据电荷和分子大小两种性质分离多肽，但在过程中有部分多肽富集到电极上，对仪器造成损害，虽然有研究通过增加超滤膜减缓这种损害，但是并不能彻底解决问题。利用电渗析分离碱性蛋白酶酶解后的菜籽蛋白分离物时，电渗析过程以KCl 为电极缓冲液，可将阴离子多肽和阳离子多肽进行分离。

3.结语

多肽种类繁多，理化性质各不相同，应根据实际情况选择不同的合成和分离纯化方法，学者们通常会采用多种分离纯化的方法提高目标肽纯度。随着多肽药物的研究和发展，人们对多肽的需求不断增加，在促使多肽行业规模不断增长的同时，对多肽药物制备工艺的要求也越来越高，这就意味着需要更多学者投入到多肽制备工艺的研究中来，并在前人研究基础上进行创新和升级，克服多肽制备工艺的各种不足，进一步满足人们的需求，相信在领域内的科研人员的共同努力下，能够有更多的多肽药物获批上市。