贵州野生蕉孢炭角菌的鉴定及其碳氮源利用的研究

尚念杰， 刘宏宇， 陈梦姣， 桂 阳

(1.贵州省农业科学院农作物品种资源研究所， 贵阳 550006； 2.贵州省食用菌育种重点实验室，贵州省农业科学院食用菌研究中心， 贵阳 550006； 3.贵阳护理职业学院， 贵州 贵阳 550006)

炭角菌属于子囊菌纲、球壳目、炭棒科、炭角菌属,其菌核幼嫩时可食用，成熟后称为乌灵参，是一种名贵的中药[1-2]。炭角菌科多为腐生菌，在系统学中具有重要价值，同时在医学领域具有很大的开发潜能，其中很多炭角菌种类具有很高的药用价值[3-4]。例如炭角菌多具有安神、止血和降血压等功效，在失眠、心悸等病症方面具有很好的治疗作用[5]。黑柄炭角菌具有补气、固肾、除湿和镇静安神功效[6]。有研究表明，不同炭角菌菌丝对碳氮源的利用和环境有不同的要求[7]。因此，探索不同炭角菌的生物学特性，对驯化、栽培及开发利用炭角菌具有重要意义。本研究旨在对野外获得的一株炭角菌进行分离鉴定，并对其进行不同碳氮源条件下培养，探究该炭角菌在不同碳氮源条件下的生长情况。

1 材料与方法

1.1 菌株的鉴定

使用液氮研磨子实体至粉末状，加1 mL CTAB混匀，65 ℃、60 min进行水浴(每5 min摇匀一次)，加DNA提取液(25∶24∶1)1 mL，混匀，室温静置5 min，离心(1 200 xg，15 min)，取上清至离心管[8]。使用DNA提取试剂盒(OMEGA，D 3195-02)提取分子标本的DNA。PCR扩增引物选择ITS 1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS 4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)PCR扩增各野生菌物的ITS序列。PCR产物送苏州金唯智生物科技有限公司测序。从GenBank数据库中检索相关亲缘相近菌株的ITS序列，然后通过CLUSTAL-X 2.0程序进行多重序列比对[9]。使用Neighbor-joining法通过使用MEGA 6软件构建系统发育树[10]。

1.2 不同碳源对蕉孢炭角菌菌丝生长速率的影响

本试验供试碳源为葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉7种。以供试基础培养基中葡萄糖的含碳量为标准，用等量含碳量的另外6种碳源分别代替，配置7种不同碳源的培养基，观察不同碳源对蕉孢炭角菌菌丝生长的影响[11]。供试基础培养基配方为：葡萄糖20 g，蛋白胨2 g，磷酸二氢钾0.5 g，硫酸镁0.5 g，氯化钙0.5 g，维生素B 1 100μg，琼脂10 g，蒸馏水1 000 mL。

1.3 不同氮源对蕉孢炭角菌菌丝生长速率的影响

本试验供试氮源为硫酸铵、草酸铵、尿素、酵母粉、蛋白胨5种。以供试基础培养基蛋白胨含量为标准，用等量含氮量的另外4种氮源分别代替，配置5种不同氮源的培养基，观察不同氮源对蕉孢炭角菌菌丝生长的影响。供试基础培养基配方同1.2。

1.4 菌丝的培养与观察

将上述培养基配制好后，按常规方法灭菌、制平板，冷却后在无菌条件下接种一块6 mm的活化菌丝块，接种后置于25 ℃恒温培养箱培养，定期观察菌丝特征，测量菌丝生长速度。

2 结果与分析

2.1 菌株的鉴定

将菌株在NCBI进行blast比对后发现，该菌株与Xylariaallantoidea较为相似。在GenBank中与Xylariasp. GSM-1 (No. KP 204382)相似度为99.15%，与Xylariaallantoidea94042903 (No.GU 324743)相似度为99.06%，与XylariaallantoideaMEL 2382670 (No.KP 013033)相似度为98.70%。实验室将该菌株命名为XylariaallantoideaGY-12，将其ITS序列上传至NCBI数据库得到相应的基因号为Accession No. MZ 597867。图1为基于ITS序列制作的XylariaallantoideaGY-12的neighbor-joining进化树。从图中可以看出，菌株GY-12与菌株XylariaallantoideaMEL 2382670和XylariaallantoideaGAB 243在一个分支上，关系最为相近。因此，菌株GY-12是属于Xylariaallantoidea一个种。

注：Bootstrap值表示为1 000次重复的百分比，Bar，0.01。图1 基于菌株GY-12的ITS基因序列和系统发育相关型菌株的NJ树

2.2 不同碳源对蕉孢炭角菌GY-12菌丝生长的影响

通过表1得知，蕉孢炭角菌GY-12菌丝生长速度以果糖、麦芽糖为碳源生长最快，日均生长分别为4.24 mm和3.67 mm；乳糖最慢，日均生长仅为1.93 mm。以果糖、麦芽糖和乳糖为碳源的处理中，菌丝长势较好，颜色洁白，菌丝浓密健壮。综合生长速度和菌丝长势，蕉孢炭角菌GY-12菌丝生长的最佳碳源是果糖和麦芽糖。

表1 不同碳源对蕉孢炭角菌GY-12菌丝生长速度的影响

2.3 不同氮源对蕉孢炭角菌GY-12菌丝生长的影响

通过表2看出，菌丝生长以酵母粉为氮源生长最快，日均生长为3.76 mm，效果最差的是硫酸铵和尿素，日均生长仅为0.57 mm和0.89 mm。菌丝长势以酵母粉为氮源长势最好，菌丝洁白、浓密健壮；硫酸铵和尿素最差，表现出菌丝细弱、稀释、浅白，生长不育。综合蕉孢炭角菌菌丝生长速度和菌丝长势，5种氮源中最佳是酵母粉。

表2 不同氮源对蕉孢炭角菌菌丝生长速度的影响

3 讨 论

本实验为鉴定从野外获得的一株炭角菌，并探究该炭角菌在不同碳氮源条件下的生长情况。研究表明，菌株GY-12与菌株XylariaallantoideaMEL 2382670和XylariaallantoideaGAB 243在一个分支上，关系最为相近，是Xylariaallantoidea的一种。在供试的7种碳源中，菌株GY-12都能够利用，但在实验中发现，菌丝生长最适碳源为果糖和麦芽糖，说明菌株GY-12的菌丝对醛糖较容易吸收利用。在供试的5种氮源中，菌丝生长最适氮源为酵母粉，最差氮源为硫酸铵和尿素。硫酸铵的效果差，可能是由于硫酸铵中随着铵离子优先被利用而引起pH值下降，使得菌丝生长减弱；由于尿素经高温处理后易分解，放出氨和氢氰酸，致使培养基的pH值升高，造成对菌丝生长的抑制。在后期可以设计最佳方案以获取菌株GY-12的最适培养基，同时对其菌丝进行液相质谱分析，为后续的药理生物活性研究奠定基础。