HIF1A可作为乳腺癌的预后标志物且与免疫细胞浸润相关

欧阳洋，李娟娟，涂毅，孙圣荣（武汉大学人民医院 乳腺甲状腺外科，湖北 武汉 430060）

乳腺癌是全球性的健康问题，其是全世界女性与癌症相关的死亡的第二大主要原因[1]。尽管使用BRCA1/2突变为主的各种致癌基因和抑癌基因的突变评估可以很好地预测乳腺癌患者的预后和治疗效果，但是因为乳腺癌表现出高度的肿瘤内异质性，乳腺癌患者的生存率仍有待提高[2-3]。近年来分子遗传学和生物标志物方面的研究进展为乳腺癌的精确诊断、个体化治疗及预后判断带来了新的希望，找到可靠、有效的生物标志物对乳腺癌的基础研究和临床治疗意义重大。

与肿瘤发生高度相关的病症之一是缺氧。缺氧诱导因子1 亚基α（hypoxia inducible factor 1 subunit alpha，HIF1A）在调节细胞对缺氧的反应中起着重要作用[4]。在正常有氧条件下，HIF1A在大多数细胞中低表达，但在缺氧条件下通常显著上调[5]。HIF1A在多种癌症中过表达，并与癌症生物学的各个方面相关，包括通过诱导血管生成促进肿瘤的发展、侵袭和转移，以及在缺氧的肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）中调节细胞代谢[6-9]。此外，HIF1A 还可以在多种免疫细胞中表达，包括巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞和淋巴细胞，从而在免疫微环境中调节固有免疫和适应性免疫[10-11]。但是关于乳腺癌组织中的HIF1A水平是否与肿瘤免疫浸润和临床结局有关，尚未进行评估。

本研究调查来自癌症基因组图谱（TCGA）计划（https://cancergenome.nih.gov/）乳腺癌患者队列中HIF1A 表达与乳腺癌患者的预后之间的关联，分析HIF1A mRNA 水平与乳腺癌患者的临床病理特征和肿瘤免疫细胞浸润的相关性，为揭示HIF1A 在乳腺癌中的重要作用及其与肿瘤-免疫相互作用之间的潜在关系和潜在机制提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 采集数据

Oncomine 数据库（https://www.oncomine.org/resource/login.html）用于评估HIF1A在各种类型癌症中的表达水平[12]。P=0.01，倍数变化为1.5，阈值为TOP10%，数据类型为mRNA。

在线数据库“基因表达谱交互式分析”（GEPIA）（http://gepia.cancer-pku.cn/index.html）是一个交互式网站，其中包含来自TCGA 和基因型-组织表达（genotype-tissue expression,GTEx）项目的9 736 例肿瘤和8 587 例正常样品中的RNA 测序表达[13]。采用GEPIA 数据对乳腺癌进行Log-Rank 检验和Mantel-Cox检验，根据基因表达情况生成生存曲线，包括OS和DFS。另外，在人类蛋白质图谱(the human protein atlas，HPA)（https://www.proteinatlas.org/）中获得HIF1A在乳腺癌组织与正常乳腺组织中的表达图谱。

从TCGA数据库中检索了1 109例乳腺癌组织和113例正常乳腺组织的转录组谱和体细胞突变信息，并从cBioportal（http://cbioportal.org）检索了相应的临床数据[14]。

1.2 HIF1A相关的信号通路富集分析

本研究根据HIF1A基因表达的中位值，将1 109个肿瘤样品标分为高表达组或低表达组，使用limma包进行基因表达的差异分析，并通过比较HIF1A 高表达组样本和低表达组样本间的差异表达基因（differentially expressed gene，DEG）。log2转换后得分变化大于1的DEG（高表达组/低表达组）和错误发现率（false discovery rate，FDR）＜0.05 被认为差异具有统计学意义。借助于ClusterProfiler、Richplot 和Ggplot2 软件包，使用R 语言对295 个DEG 进行了基因本体（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）富集分析,仅将P值和q值均＜0.05 的项被认为是显著富集的。

1.3 肿瘤免疫分析

基于RNA-Seq数据，利用“Cibersort”R包来估计单样本中22种免疫细胞的丰度[15]。

1.4 IHC检测乳腺癌组织中HIF1A的表达水平

选取2011年1月至2015年12月在武汉大学人民医院收治的乳腺癌93 例，14 例良性乳腺疾病作为对照。癌组织和良性乳腺疾病组织经甲醛固定、石蜡包埋。从病历和病理报告中提取临床信息，所有患者均未接受化疗、放疗或免疫治疗。本研究经武汉大学人民医院伦理委员会批准，并征得所有患者知情签字同意。IHC 染色如下：脱蜡、抗原修复、封闭，以一抗（HIF-1α，Abcam 公司，ab51608）处理（稀释1∶100，37 ℃2 h），洗涤，封闭，以辣根过氧化物酶偶联的二抗（优宁维生物公司）处理（稀释1∶500，37 ℃30 min），洗涤，并用二氨基联苯胺染色。染色结果由两位独立的高资质的病理医生根据阳性染色肿瘤细胞的比例和染色强度进行评分。HIF1A 的表达水平根据ImageJ 软件计算的阳性细胞百分比来描述。肿瘤细胞比例评分：0（＜10%阳性细胞），1（10%～＜20%阳性细胞），2（20%～＜50%阳性细胞）或3（≥50%阳性细胞）。蛋白质染色强度评分：0（无染色），1（弱染色，浅棕色），2（中度染色，棕色）或3（强染色，深棕色）。

1.5 统计学处理

应用SPSS 22.0和R4.0.1软件进行分析。计量资料以中位数（下四分位数，上四分位数）表示，采用非参数Mann-WhitneyU检验；计数资料以例数和百分数表示，用Kaplan-Meier 法绘制患者生存曲线，生存率的比较采用Log-Rank检验。HIF1A表达量与乳腺癌患者临床病理特征的关系分析使用χ2检验及Fisher确切概率法，采用Spearman偏相关分析法分析HIF1A 基因表达与肿瘤免疫浸润细胞的关系。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 HIF1A高表达的乳腺癌患者预后较好

利用Oncomine数据库数据分析了各种类型癌症的肿瘤组织和正常组织中HIF1A mRNA 的水平，与正常组织相比，HIF1A 在大多数肿瘤组织（包括膀胱癌、中枢神经系统肿瘤、乳腺癌、宫颈癌、胃癌、肾癌、白血病、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和肉瘤）中的表达均较高（图1A）。此外，通过检测HPA中数据发现，HIF1A 在乳腺癌组织中表达较强，而在正常乳腺组织中表达较弱或呈阴性（图1B、C），进一步在临床病理方面验证了HIF1A 在乳腺癌中高表达的趋势。

接着分析了HIF1A表达与乳腺癌患者预后的相关性，发现HIF1A与乳腺癌DFS 显著相关，低HIF1A表达组预后明显差于HIF1A 高表达组（HR=0.67，P=0.036），但未观察到HIF1A 与乳腺癌患者OS 之间有明显的相关性（HR=1.2，P=0.2）（图1D、E）。因此，可以推断，HIF1A低表达可能是乳腺癌患者预后不良的危险因素。

图1 HIF1A在乳腺癌患者中的表达水平及其与患者生存关系的分析

2.2 乳腺癌组织中HIF1A的表达与病理特征的关系

为了研究乳腺癌中HIF1A表达与临床病理特征之间的关系，采用中位数切割法，计算得截断值为6 442 counts，根据此值将乳腺癌患者分为高表达组和低表达组。结果发现HIF1A 与患者雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕酮受体（progesterone receptor，PR）和人类表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）表达明显有关联（表1）。接下来，在TCGA数据集中进一步检测到肿瘤组织中HIF1A 在ER 阴性组、PR 阴性组和HER2 阳性组中表达上调（图2A～C）。还观察到HIF1A 在基底样乳腺癌和HER2 过表达型乳腺癌比luminal A、luminal B及正常组织中的表达明显升高，而在luminal A和luminal B乳腺癌亚型中没有发现差异（图2D）。

图2 在TCGA队列中HIF1A在不同的ER（A）、PR（B）、HER2（C）状态和分子亚型（D）肿瘤组织中的表达

表1 TCGA队列中HIF1A mRNA表达与临床病理特征的关系[n(%)]

2.3 中国人乳腺癌组织中HIF1A高表达

HIF1A 在国人乳腺癌组织中的病理表达特征见表2。与乳腺良性组织相比，乳腺癌中HIF1A表达水平明显升高（P＜0.01；图3）。分析乳腺癌各个亚型中HIF1A 的表达水平，发现与正常组织相比，各个亚型中HIF1A 的表达水平均升高（均P＜0.01），但是没有观察到各个亚型之间HIF1A 表达水平的差异。以Kaplan-Meier 分析乳腺癌患者RFS表明，表达低水平HIF1A 的患者比表达高水平HIF1A 组的患者预后更差（P＜0.05）。以上结果表明，中国人癌组织标本中HIF1A低表达可能是乳腺癌患者预后不良的因素，可以作为乳腺癌患者预测预后的指标。

图3 中国人乳腺癌组织中HIF1A的表达水平及其与患者DFS的关系

表2 HIF1A在中国人乳腺癌组织中的病理表达特征[n(%)]

2.4 与HIF1A 相关的DEG 与乳腺癌的免疫功能密切相关

为了探索乳腺癌中HIF1A表达相关的生物学过程，对HIF1A 高表达组和低表达组样本进行DEG 分析，总共获得了295 个DEG，其中179 个基因表达上调、116 个基因表达下调。随后，进行GO 和KEGG 富集分析。GO 富集分析结果表明，HIF1A参与白细胞趋化反应、由抗菌肽介导的抗体液免疫反应、粒细胞趋化反应、趋化因子信号转导途径和嗜中性粒细胞趋化反应等（图4A）。KEGG 富集分析还显示了细胞因子与细胞因子受体间相互作用通路和IL-17 信号通路（图4B）。结果表明，HIF1A 表达与乳腺癌患者的免疫功能相关，提示HIF1A可能参与乳腺癌TME的调节。

图4 GO（A）和KEGG（B）富集分析显示HIF1A相关DEG与免疫功能有关

2.5 HIF1A 表达影响肿瘤浸润免疫细胞（tumorinfiltrating immune cell，TIC）的群谱特性

为了进一步证实HIF1A 表达与TME 的相关性，使用Cibersort算法分析了TIC亚群的比例，并在乳腺癌样品中构建了22 种免疫细胞谱。差异分析发现，HIF1A高表达组表现出较高水平的静息记忆CD4+T细胞（P＜0.01）、活化记忆CD4+T 细胞（P＜0.000 1）、M0 型巨噬细胞（P＜0.01）和M1 型巨噬细胞（P＜0.01）。另外，HIF1A 高表达组表现出较低水平的Treg 细胞（P＜0.01）、活化NK 细胞（P＜0.000 1）、单核细胞（P＜0.01）、M2型巨噬细胞（P＜0.001）和静息肥大细胞（P＜0.000 1）（图5A）。相关性分析表明，总共8 种TIC 与HIF1A 的表达相关，其中记忆型B 细胞、Treg 细胞、活化NK细胞、静息肥大细胞、M2型巨噬细胞与HIF1A 表达呈负相关，而静息记忆CD4+T 细胞、活化记忆CD4+T 细胞、M1 型巨噬细胞与HIF1A 表达呈正相关（图5B）。这些结果进一步支持了HIF1A表达水平影响TME的免疫活性。

图5 HIF1A表达与TIC群谱相关性分析

3 讨论

缺氧是导致肿瘤侵袭性微环境最常见的特征之一。瘤内低氧激活HIF-1 和HIF-2，在几种人类癌症中已证明HIF1A的表达与肿瘤转移和死亡率密切相关[16]。特别是在多形性胶质母细胞瘤、成血管细胞瘤、结肠腺癌、肺癌、前列腺癌和乳腺癌的亚型中观察到HIF1A 高表达，HIF1A 是缺氧、血管生成、细胞增殖、代谢、癌症进展和转移的主要调节剂[17]。本研究结果表明，与正常乳腺组织相比，HIF1A 在乳腺癌中表达显著上调，并且与乳腺癌患者良好DFS 预后相关。然而，一些文献报道了HIF1A 在乳腺癌中的致癌和促癌作用。EBRIGHT等[8]报道了HIF1A信号选择性促进了乳腺癌脑转移，CHEN 等[18]也报道了HIF1A 可以诱导表观遗传阅读器锌指MYND 型8（eigenetic reader zinc finger MYND-type containing 8，ZMYND8）表达上调，从而促进体外乳腺癌细胞集落的形成、迁移和侵袭，并促进了小鼠乳腺肿瘤的生长和向肺的转移。造成这种不一致的主要原因是本研究在整体水平上分析了HIF1A 的表达。KACHAMAKOVA-TROJANOWSKA 等[19]最近的研究也支持了本研究的发现，HIF1A的稳定化可降低肿瘤细胞的侵袭性，在体外和体内的乳腺癌细胞中发挥抗癌作用，并增强了吉西他滨化疗的疗效。此外，TIWARI 等[20]研究结果也表明，HIF1A 可以促进胰腺癌细胞中p53蛋白的降解来发挥肿瘤抑制作用，胰腺癌细胞中HIF1A的缺失增加了他们的侵袭和转移活性。这些数据共同表明，HIF1A在乳腺癌中发挥着抑癌和促癌的双重作用[21-22]。

此外，本研究还发现在TCGA 队列中HIF1A mRNA 水平与ER、PR 表达呈负相关，和HER2 的状态呈正相关。其中HIF1A 在HER2 过表达型乳腺癌中表达最高，这与之前报道的HER2 通过增加PI3K/Akt/mTOR 信号转导来增加HIF1A 水平相一致[23]。此外在一些研究中发现，患者乳腺肿瘤中的HIF1A免疫组化表达水平与HER2阳性相关[24]。

HIF1A 参与了肿瘤相关炎症信号的内源性和外源性激活[25]。实体肿瘤的生长速度最终超过氧气和营养的供应，导致局部坏死[16,25]。肿瘤的缺氧和坏死区域反过来产生促炎介质，招募更多的免疫细胞，从而促进肿瘤部位的免疫反应以及抑制肿瘤细胞的增殖、血管生成和转移[25-26]。本研究通过GO 和KEGG富集分析，证实了HIF1A 与乳腺癌中免疫活性以及炎症反应有关，例如白细胞趋化反应、趋化因子反应、IL-17信号通路等。

HIF1A作为缺氧的主要调节因子，可直接或间接调控缺氧介导的肿瘤免疫逃逸[27-28]，在免疫调控和炎症反应中发挥重要作用[10-11,29]。与肿瘤细胞一样，浸润性免疫细胞也暴露在缺氧环境中，因为他们从富含氧气的血流中外溢到炎症部位，从而激活免疫细胞中的HIF1A[30]。而髓细胞中HIF1A 的缺失导致细胞ATP池的减少，并且严重损害了髓细胞聚集、运动性、侵袭性、抗菌活性和存活时间[30-31]。在癌症免疫学的背景下，Treg 细胞可以抑制自身反应性T 细胞，从而发挥抑制肿瘤免疫的作用，Treg 细胞数量多与CD8+T细胞比例低与预后不良相关[32]。在本研究中，通过Cibersort软件对TIC比例进行分析结果表明，乳腺癌患者中Treg 细胞与HIF1A 表达呈负相关。此外，还发现HIF1A与M0和M2型巨噬细胞呈负相关，与M1 型巨噬细胞呈正相关。巨噬细胞在TME 中浸润非常丰富，在一些恶性肿瘤中他们的高浸润与不良预后和治疗耐药性相关[33]。由于他们的可塑性，巨噬细胞可以极化为促炎、抗肿瘤M1 型或极化为抗炎、促肿瘤M2型[34]。M1型巨噬细胞通过分泌促炎性细胞因子和趋化因子，并专职提呈抗原，参与正向免疫应答，发挥免疫监视的功能。而M2型巨噬细胞仅有较弱抗原提呈能力，并通过分泌抑制性细胞因子IL-10或TGF-B等下调免疫应答，在免疫调节中发挥重要作用[35]。以上这些结果表明，HIF1A低表达抑制了肿瘤内炎症反应，导致肿瘤内Treg 细胞、抗炎M2型巨噬细胞浸润增加，促炎M1 型巨噬细胞浸润减少，形成肿瘤免疫抑制微环境，导致免疫逃逸，这可能是乳腺癌患者预后不良的原因。总之，乳腺癌患者的TIC 与HIF1A 密切相关，提示HIF1A 可能是维持TME中免疫活性的重要因素。

必须承认本研究存在局限性。首先是缺乏动物实验来证实HIF1A在乳腺癌生长和进展中的作用及其与TME 中免疫细胞浸润的关系。因此，需要进一步的研究以验证HIF1A在使用这些模型的乳腺癌中的作用。其次，本研究缺少对调控HIF1A 具体机制的研究，有必要进一步探索乳腺癌中HIF1A 可能的调控因子。