miR-452-5p靶向SOX7促进食管癌KYSE-150细胞增殖、侵袭及EMT

尹情，韩俊淑，董稚明，郭炜，沈素朋，梁佳，路军涛，郭艳丽（河北医科大学第四医院 河北省肿瘤研究所，河北石家庄 050011）

miRNA是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，通过特异性靶向mRNA的3'-UTR抑制靶基因的表达和蛋白质翻译。越来越多的证据表明，miRNA在肿瘤发生发展中具有重要意义。miR-452-5p 在多种肿瘤中均异常表达，如肺癌[1]、肝癌[2-3]、结肠癌[4]和肾细胞癌[5]等，并影响肿瘤的恶性进程，而食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell cancer，ESCC）中miR-452-5p的研究则罕有报道。LIU等[6]在食管癌芯片检测中发现食管癌组织中miR-452-5p表达较癌旁组织明显上调，但其在ESCC中的具体作用及机制并未阐明。本研究重点探讨miR-452-5p对ESCC细胞增殖、侵袭能力的影响，及其在EMT过程中的生物学作用和潜在的分子机制，以期为ESCC的治疗和预后评估提供新的候选标志物。

1 材料与方法

1.1 研究对象和主要试剂

收集2012 年3 月至2015 年12 月在河北医科大学第四医院就诊的86 名ESCC 患者的癌组织样本和对应的癌旁组织。全部患者术前均未经化疗和放疗。肿瘤组织切除术后，在20 min内收集标本，一部分立即用液氮转至-80 ℃低温冰箱保存，用于提取RNA；另一部分进行石蜡包埋，常规H-E 染色，经病理医师诊断证实癌组织均为ESCC，癌旁组织均为食管正常黏膜组织。86例ESCC患者全部进行了随访，共有2 人失访。本研究方案经河北医科大学第四医院伦理委员会审查通过（审批号：2019EMC012），所有入选患者均被告知并签署知情同意书。

食管癌KYSE-150 细胞由河北医科大学第四医院生物样本库留存。TRIzol 购自Invitrogen 公司，逆转录试剂盒（FuGENE HD Transfection Reagent）购自Roche 公司，双荧光素酶报告基因检测试剂盒、LipofectamineTM2000 转染试剂、MTS 试剂均购自Promega 公司，RPMI 1640 培养基购自Gibco 公司，Transwell 小室及人工基膜（matrigel）购自Corning 公司，miR-452-5p mimic 购自GenePharma 公司，TOPFLASH、FOP-FLASH 质粒购自Millipore 公司，引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2 细胞培养及处理

KYSE-150细胞复苏并培养于含10%FBS的RPMI 1640培养基中，在37 ℃、5%CO2的孵箱中培养。将处于对数生长期的KYSE-150 细胞接种在6孔板中（2×105个/孔），待细胞生长汇合度至70%～80%时，按照LipofectanineTM2000 转染试剂说明书分别将pcDNA3.1-SOX7、阴性对照（negative control，NC）或miR-452-5p mimic 及相应阴性对照（miR-NC）进行转染，qPCR 验证转染效率；或将Wnt/β-catenin 信号通路特异性激活剂LiCl加入培养基处理KYSE-150 细胞，使其终摩尔浓度为20 mmol/L，同时换以20 mmol/L NaCl处理细胞作为阴性对照组。

1.3 qPCR法检测miR-452-5p及其他相关基因的表达

按TRIzol 试剂说明书提取组织及KYSE-150 细胞中总RNA，SynergyHT 多模式微孔板检测仪（美国Biotek 公司）测定总RNA 的浓度和纯度。参照逆转录试剂盒说明将RNA 逆转录成cDNA，采用ABI7500 qPCR 仪检测miR-452-5p、Wnt 通路相关基因及EMT 相关基因的表达，并分别以U6 或GAPDH基因作为内参照。引物序列见表1。目的基因的相对表达量用2-△△Ct法计算。

表1 qPCR引物

1.4 MTS法检测KYSE-150细胞的增殖能力

将KYSE-150细胞接种于96孔板中（3×103个/孔），每组设置6个复孔，分别于细胞贴壁后0、24、48 和72 h时在每孔中加入20 μL（500 μg/mL）MTS试剂，37 ℃、5%CO2培养箱中培养2 h，用酶标仪在490 nm波长处检测每个孔的光密度（D）值。实验重复3次。

1.5 Transwell法检测KYSE-150细胞的侵袭能力

常规消化并悬浮KYSE-150 细胞于无血清培养基中，调整细胞密度接种于预铺matrigel的上小室（1×105个/孔）内，下小室内加入600 μL含10%FBS的RPMI 1640培养基，培养24 h后，用4%多聚甲醛固定细胞，0.1%结晶紫染色5 min，最后，在显微镜下（×200）随机对5个视野的细胞进行拍照并计数。

1.6 双荧光素酶报告基因实验验证miR-452-5p 与SOX7的靶向关系

通过TargetScan 软件预测miR-452-5p 与SOX7（SRY-box transcription factor 7，SOX7）之间存在的互补结合位点。将含有野生型（WT）SOX7 3'UTR的核苷酸片段克隆至pmirGLO 荧光素酶报告质粒载体。按照LipofectamineTM2000 转染试剂说明书将野生型的pmirGLO-SOX7 与miR-452-5p-mimic 或miR-NC质粒共转染KYSE-150细胞，继续培养48 h后收集细胞，用双荧光素酶报告系统检测荧光素酶活性。同时，为了检测Wnt 通路活性，将TOP-Flash 或FOPFlash（TOP-Flash 突变体）与内参照质粒pRLTK 一起转染KYSE-150细胞，并于转染48 h后用双荧光素酶报告检测系统检测荧光素酶活性。结果以TOP/FOP比值表示，其中TOP值为转染有TOP-Flash和内参照质粒的样本中采集得到的萤火虫荧光值/海肾荧光值；FOP 值为转染有FOP-Flash 和内参照质粒的样本中采集得到的萤火虫荧光值/海肾荧光值。

1.7 统计学处理

所有实验均独立重复3 次。采用SPSS19.0 统计软件对实验数据进行统计分析，符合正态分布的计量数据以表示，两组间比较采用独立样本t检验。以P＜0.05或P＜0.01表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-452-5p在ESCC组织中呈高表达

qPCR 检测结果显示，ESCC 组织中miR-452-5p表达量明显高于癌旁组织（P＜0.01，图1A、B）。与癌旁组织相比，85.1%（74/86例）的ESCC患者癌组织中miR-452-5p 呈高表达（P＜0.01，图1C）。UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html）网站数据分析显示，miR-452-5p在ESCC中表达明显高于癌旁组织（均P＜0.01，图1D），与本实验检测结果一致。

图1 miR-452-5p在ESCC组织中呈明显高表达

2.2 miR-452-5p 表达与ESCC 患者临床病理特征和OS的关系

86 例ESCC 患者中，男性48 例、女性38 例；年龄39～78 岁，中位年龄57.6 岁；其中高、中分化ESCC 患者49例，低分化ESCC患者37例；有淋巴结转移患者69例，无淋巴结转移患者17例；依据美国癌症联合会临床分期标准进行分期，其中Ⅰ、Ⅱ期患者41例，Ⅲ、Ⅳ期患者45 例。根据临床病理特征进行分组比较，miR-452-5p 表达水平与ESCC 患者的淋巴结转移及TNM 分期有关（P＜0.05），而与患者的年龄、性别、病理分级无关（P＞0.05，图2A）。

应用Log-Rank 法分析miR-452-5p 表达高低对ESCC患者5年OS的影响，miR-452-5p表达的高低以均值为分界点进行分组，其中高表达组47例、低表达组39例。分析结果显示，低表达组患者的5年OS为23.1%（中位OS为34个月），高表达组患者5年OS为9.2%（中位OS 为23 个月）。Log-Rank 检验分析结果（图2B）显示，miR-452-5p高表达患者的5年OS明显低于低表达患者的5年OS（χ2=5.285，P=0.022）。

图2 ESCC组织中miR-452-5p表达与临床病理特征（A）和OS（B）的关系

2.3 miR-452-5p过表达促进KYSE-150细胞的增殖、侵袭能力及EMT进程

qPCR 验证miR-452-5p mimic 转染效果，结果显示转染组miR-452-5p 表达明显高于相应阴性对照（miR-NC）（P＜0.01）。MTS 法、Transwell 实验检测结果显示，与miR-NC 对照组相比，miR-452-5p mimic转染组KYSE-150 细胞的增殖（P＜0.01，图3A）及侵袭能力（P＜0.05，图3B）明显增强。qPCR法检测结果（图3C）显示，转染miR-452-5p mimic 促使KYSE-150细胞中上皮标志物E-cadherin 的表达水平明显下调（P＜0.01），而间质标志物N-cadherin、SNAI1 及VIM表达水平明显上调（P＜0.05或P＜0.01）。以上结果提示，miR-452-5p 促进KYSE-150 细胞的增殖、侵袭能力及EMT进程。

图3 miR-452-5p对食管癌KYSE-150细胞增殖（A）、侵袭能力（B，×200）及EMT相关基因表达（C）的影响

2.4 miR-452-5p靶向调控SOX7基因并抑制其表达

为进一步明确miR-452-5p发挥生物学功能的可能机制，运用多个生物信息学数据库（miRDB、TargetScan7.1 和miRWalk）预测miR-452-5p 潜在的靶基因。取评分较高的前30%的基因进行交集，共得9 个基因（图4A），其中SOX7 被报道与多种肿瘤的发生发展密切相关，本研究选取SOX7基因进行下一步研究。图4B展示了SOX7与miR-452-5p的结合位点。在KYSE-150细胞中转染miR-452-5pmimic后，发现可明显降低SOX7基因的表达水平（P＜0.01，图4C）；双荧光素酶报告基因实验结果也显示miR-452-5p的过表达明显降低了荧光素酶活性（P＜0.01，图4D）。上述结果表明，miR-452-5p 通过直接结合SOX7 基因的3'-UTR 区抑制SOX7 基因的表达，即SOX7是miR-452-5p的直接靶基因。

图4 miR-452-5p靶向SOX7基因并抑制其表达

2.5 miR-452-5p 通过靶向调控SOX7 基因的表达增强了Wnt/β-catenin信号通路的活性

有文献[7]指出SOX7 是Wnt/β-catenin 信号通路的抑制因子之一，所以本研究要进一步探索miR-452-5p在Wnt信号转导中的作用。应用经典TOP/FOP-Flash报告基因系统来评估Wnt/β-catenin信号通路的活性，结果表明，与对照细胞相比，过表达miR-452-5p显著增强了KYSE-150 细胞中Wnt/β-catenin 信号通路的活性（P＜0.01，图5A）；而SOX7 的过表达可导致TOP/FOP荧光素酶活性降低（P＜0.01，图5B）。此外，qPCR 结果显示，miR-452-5p mimic 明显上调了Wnt通路靶基因MYC、MMP-7 和CyclinD1 的表达（均P＜0.01；图5C）；而SOX7 的过表达则部分抑制了miR-452-5p 对靶基因的上调作用（P＜0.05 或P＜0.01；图5C）。以上结果表明miR-452-5p 靶向SOX7 抑制了Wnt/β-catenin信号通路的活性。

图5 miR-452-5p靶向SOX7基因并抑制Wnt/β-catenin通路活化水平

2.6 miR-452-5p表达受Wnt/β-catenin通路活化水平的影响

PROMO网站预测发现，miR-452-5p启动子区有多个TCF4/LEF1转录因子的结合位点（图6A）。应用Wnt 通路激活剂LiCl 处理KYSE-150 细胞6、12 及24 h，NaCl处理作为对照组，TOP/FOP荧光素酶活性分析表明，随着LiCl处理时间的增加，TOP/FOP荧光素酶活性比值（均P＜0.01，图6B）及miR-452-5p的表达量也随之增加（P＜0.05 或P＜0.01，图6C），SOX7 的表达却随着LiCl 处理时间的增加而下降（P＜0.05 或P＜0.01；图6C）。提示miR-452-5p 在靶向调控Wnt 信号通路的同时也受Wnt 通路活化水平的影响，其可能为Wnt/β-catenin通路的下游靶基因，即形成了miR-452-5p/SOX7/Wnt/miR-452-5p正反馈环路。

图6 miR-452-5p表达受Wnt/β-catenin通路活化水平的影响

3 讨论

ESCC是消化系统最常见的恶性肿瘤，深入了解ESCC发生发展的分子机制有利于寻找更安全、更有效的治疗靶点。近年来，大量研究表明miRNA可作为癌基因或抑癌基因在肿瘤的发生发展中起着重要作用。miR-452-5p的异常表达及其作用已在多种恶性肿瘤被报道，在肝细胞癌中miR-452-5p可以促进癌细胞的浸润和转移[8-9]；miR-452-5p的高表达与肾癌的不良预后密切相关[10]；在尿路上皮癌中发现，miR-452-5p在转移阳性淋巴结中高表达，提示其具有促进转移的作用[11]。然而，在胰腺癌[12]、乳腺癌[13]中，miR-452-5p则表现为对肿瘤的抑制。可见，miR-452-5p的生物学功能具有很强的肿瘤特异性。本研究发现miR-452-5p在ESCC癌组织中的表达显著升高，与在UALCAN数据库中分析miR-452-5p在ESCC中高表达的结果一致。在探讨miR-452-5p表达与ESCC 临床病理特征之间的关系时发现，miR-452-5p高表达与ESCC患者的淋巴结转移和TNM 分期密切相关。体外功能学实验结果显示，miR-452-5p过表达明显促进了ESCC细胞的增殖及侵袭能力。此外，Kaplan-Meier分析表明，miR-452-5p高表达与ESCC患者的不良预后密切相关。以上结果均提示，miR-452-5p可能在ESCC侵袭、转移等恶性进程中扮演着重要的角色，并可能是ESCC患者预后不良的潜在预测因子。

EMT是癌细胞失去上皮表型并获得间充质表型的过程，已被证实会导致肿瘤细胞的迁移和侵袭。为进一步明确miR-452-5p可促进ESCC侵袭性临床表型的潜在分子机制，本研究首先检测了miR-452-5p对EMT进程的影响，结果显示miR-452-5p过表达明显降低了上皮标志物的表达水平，而上调了间质标志物的表达，提示miR-452-5p促进了ESCC的EMT进程。接下来，进一步探讨了miR-452-5p促进ESCC EMT 进程的可能分子机制。通过生物信息学预测发现，SOX7 基因3'UTR 区与miR-452-5p 有潜在的结合位点，并通过实验证明了SOX7是miR-452-5p的直接靶基因。研究指出SOX7在多种肿瘤中通过抑制Wnt/β-catenin通路发挥抑癌基因的作用，例如脑胶质瘤[14]、肾细胞癌[7]、卵巢癌[15]、结直肠癌[16]、前列腺癌[17]等。Wnt/β-catenin通路调控细胞的许多生命过程，该通路的异常活化在EMT 进程中发挥着重要作用[18]。Wnt/β-catenin信号通路在异常活化时，通路的中心因子β-catenin由胞质易位于细胞核，与LEF/TCF转录因子家族结合，调节下游靶基因的转录[19-21]；而SOX7可与TCF竞争结合β-catenin，从而阻断了β-catenin-TCF 介导的基因转录激活，遏制Wnt/β-catenin通路的活性[7，17]。SOX7对Wnt/β-catenin信号通路的拮抗作用促使本研究进一步探索了miR-452-5p在Wnt信号通路中的作用。TOP/FOP荧光素酶分析及Wnt通路靶基因检测结果显示，miR-452-5p通过对SOX7基因的抑制作用明显提高了Wnt通路活性。同时，实验中发现一个有趣的现象，在应用Wnt通路激活剂LiCl处理细胞时，随着处理时间的增加，荧光素酶活性及miR-452-5p的表达量也随之增加，而SOX7的表达量则随之下降。进一步结合转录因子预测网站PROMO数据分析，发现在miR-452-5p启动子区有多个TCF4/LEF1 转录因子的结合位点，β-catenin与TCF/LEF转录因子结合促进下游靶基因的转录是Wnt通路活化的经典模式。以上研究结果提示，miR-452-5p在靶向激活Wnt/β-catenin信号通路的同时，其本身也受Wnt/β-catenin通路活化影响，其自身可能为Wnt/β-catenin通路的下游靶基因。miR-452-5p表达的变化进一步通过对SOX7的靶向调控影响了Wnt 信号通路的活化水平，即形成了miR-452-5p/SOX7/Wnt/miR-452-5p正反馈环路。

综上，本研究揭示了miR-452-5p在ESCC组织中表达明显上调。miR-452-5p 的高表达促进了食管癌KYSE-150 细胞的增殖、侵袭能力及EMT 进程。miR-452-5p 通过miR-452-5p/SOX7/Wnt/miR-452-5p正反馈环路提高了Wnt/β-catenin通路活化水平，进而促进KYSE-150 细胞的EMT 进程。miR-452-5p 有望为ESCC患者的治疗提供潜在分子靶点，同时也为预后评估提供一种新的标志物。