触脑脊液神经元生理特性与功能的研究进展

2022-07-08 04:08王洪超何宇祺李青

医学综述 2022年12期

王洪超，何宇祺，李青

(1.贵州医科大学临床医学院，贵阳 550025； 2.贵州医科大学附属医院创伤骨科，贵阳 550004)

触脑脊液神经元(cerebrospinal fluid-contacting neurons，CSF-cNs)简称触液神经元，是一组直接与脑脊液接触的中间神经元亚群，产生于神经发育晚期。有学者首次在两栖动物视网膜中观察到直接与脑脊液接触的双极神经元[1]。随后，Dale等[2]在许多脊髓动物中发现了双极神经元能够在第三脑室和脊髓中央管区域通过顶端延伸接触脑脊液，并称其为“KA(Kolmer-Agduhr)细胞”。1989年，Vigh-Teichmann和Vigh[3]将此类神经元正式命名为“CSF-cNs”。它几乎存在于所有脊椎动物中，可分为室管膜上、室管膜下和远位CSF-cNs三类[4]。既往人们认为，CSF-cNs所处的位置及其纤毛表明它可以感知脑脊液流动、压力及pH值的变化，并分泌神经递质[5]，还可参与疼痛、应激和药物成瘾等[6]。但因缺乏特异性标志物，人们对其功能仍不十分清楚。有研究证实，多囊肾病蛋白2-样1离子通道(polycystin kidney disease 2-like 1，PKD2L1)可特异性标记脊椎动物室管膜区与脑脊液接触的CSF-cNs群体，目前多采用PKD2L1特异性抗体对CSF-cNs进行免疫荧光及免疫组织化学标记[7-8]。PKD2L1+CSF-cNs是γ-氨基丁酸能神经元，现已证明其在体外具有神经干细胞特性，是内源性神经干细胞组成之一[9]。因此，研究其生理功能可能为脊髓损伤后的内源性修复提供新的切入点。现就CSF-cNs生理特性与功能的研究进展予以综述。

1 CSF-cNs的分布及分类

在哺乳动物中，CSF-cNs的主要类型位于脊髓中央管的室管膜层及脊髓实质内，其他分布于脑室管膜附近，如侧脑室、第三脑室、导水管下部(Aq)和第四脑室(4V)底板上部的腹侧灰质内[10]，也存在于海马、中缝背核等脑实质内[11]。

根据CSF-cNs的形态和与室管膜的位置关系，其可以分为三类：①室管膜上CSF-cNs，其胞体位于脊髓中央管的室管膜表面，直接与脑脊液相接触；②室管膜下CSF-cNs，其胞体位于室管膜层，多为双极，通过轴突延伸至脑脊液或邻近的脑实质，其树突粗短，末端膨大，表面含有动、静纤毛，可感受脑脊液机械和化学变化；③远位CSF-cNs，其胞体位于距离室管膜较远的脑实质，呈梭形或多边形，树突丰富，轴突较长，伸向邻近脑室或其他脑区[4,12]。

2 CSF-cNs的发育起源

在小鼠和斑马鱼等脊椎动物中，CSF-cNs起源于两个不同的祖细胞结构域，其特征是表达不同的转录因子[13-14]。除了祖细胞结构域，神经发生的时间在神经元多样化中起决定作用。为了确定脑脊液中枢神经系统发育的时间，Petracca等[15]在小鼠中，通过转录因子GATA2和GATA3以及离子通道PKD2L1阳性表达来鉴定CSF-cNs，他们在胚胎发育第14.5天时发现了第一个PKD2L1+细胞，此发育阶段被称为神经胶质细胞和室管膜细胞生成期，脊髓神经发生基本消失[16-17]，但随着发育的进行，CSF-cNs数量增加，在第16.5天后保持相对恒定。研究表明，小鼠CSF-cNs起源于两个不同的中央管背、腹侧坐标的晚期祖细胞：①CSF-cNs′细胞约70%来源于Olig2+p2区域的Nkx6.1+/Pax6+祖细胞，约30%源自Olig2+的pOL区域的后半部；②CSF-cNs″细胞则由l-p3区域中的Nkx2.2+/Foxa2+祖细胞分化而来[15]。斑马鱼脊髓中央管中的KA细胞由KA′和KA″两个亚群组成，其中KA′细胞来自PMN区域中的Olig2+祖细胞，KA″细胞是由LFP区域中的Nkx2.2a+/Nkx2.9+祖细胞分化而来[18]。虽然小鼠的CSF-cNs和斑马鱼的KA细胞在背腹位置和标记表达上有相似之处，但与小鼠CSF-cNs的晚期发育相比，斑马鱼中KA细胞的出现于自身其他脊髓神经元发生之前或同时发生[19-20]，这种异时性发育可能与羊膜动物和非羊膜动物中CSF-cNs和KA的不同功能有关[15]。

3 CSF-cNs的示踪剂和特异性标志物

3.1示踪剂的演变为寻求可靠的标记方法，Song等[11]对辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)和霍乱毒素亚单位B与HRP复合物(cholera toxin subunit B conjugated with HRP，CB-HRP)两种方法进行了比较。由于HRP可自由通过脑脊液-脑屏障，扩散至脑实质，应用HRP顺行法标记CSF-cNs很难得出科学的结论。因此，寻求一种只标记CSF-cNs的示踪剂至关重要。CB-HRP是一种酶标配体示踪剂，其注入侧脑室后仅局限于脑室系统，不能自由通过血-脑屏障进入脑实质，只可被具有远端延伸的CSF-cNs终末吸收，标记效果优于HRP。因此，早期应用CB-HRP标记CSF-cNs来探索其起源、生长发育、功能是可行的。此外，CSF-cNs还可以通过GATA2和GATA3的表达来鉴定。

3.2CSF-cNs的特异性标志物虽然用CB-HRP标记CSF-cNs是可行的，但仍缺乏识别这些细胞的特异性标志物。Huang等[21]通过建立PKD2L1表达增强绿色荧光蛋白转基因小鼠，意外发现CSF-cNs中存在PKD2L1离子通道，这一发现为CSF-cNs的后续研究提供便利并成为研究新热点。PKD2L1是“瞬时受体电位”超家族中多囊藻毒素亚型的成员，是形成高电导的非选择性阳离子通道，其活性受电压、钙、质子、细胞外pH值和渗透压等影响[22]。多囊藻毒素通道存在于各种组织中，包括睾丸、肾脏和视网膜，也存在于脑组织和脊髓中。PKD2L1最初在小鼠出生后P1～P4阶段脊髓的CSF-cNs中被发现[21]，Djenoune等[18]研究了PKD2L1在小鼠脊髓中的表达，在胚胎发育第14.5天时，颈髓中可见少量PKD2L1+细胞；从胚胎发育第16.5天开始，定位于中央管周围的PKD2L1+细胞呈典型的CSF-cNs形态，胞体通常位于室管膜下，在成年小鼠中也如此；并通过检测小鼠、猕猴和斑马鱼等脊椎动物CSF-cNs中PKD2L1的表达，证明了PKD2L1是脊椎动物共享的CSF-cNs的特异性标志物。虽然脑中多囊藻毒素通道的确切功能尚不清楚，但它们通常与细胞外信号的感觉整合有关，在一些组织中被认为是机械感受器[23-24]和化学感受器[11,25]。由于CSF-cNs的特殊位置，它可能具有检测脑脊液化学和机械信号的功能，与之前CSF-cNs参与脑脊液稳态调节的假设相一致。Orts-Del′Immagine等[26]利用膜片钳法对野生型和突变型PKD2L1小鼠脑干切片中的CSF-cNs进行膜片钳全细胞记录，证明了CSF-cNs自发激活的单一电流是由PKD2L1通道引起，因此PKD2L1可能有助于CSF-cNs细胞的激活，并成为这些特殊神经元的重要兴奋性输入。另外，CSF-cNs可以通过激活PKD2L1和酸敏感离子通道(acid-sensing ion channel，ASIC)来区分周围环境的碱化和酸化[26]。

4 CSF-cNs的功能

4.1分泌功能根据对CSF-cNs超微结构的观察，有学者提出，CSF-cNs胞体和树突可基于包含突触小泡和致密囊泡的轴突末梢组成神经分泌系统，这些末梢通过半桥粒附着在神经组织外表面的基底层上并聚集突触小泡，因此CSF-cNs通过顶端延伸至脊髓中央管接收脑脊液信号，并将这些信号转化为神经分泌输出，通过轴突传达出去[27-28]。研究表明，不同物种中不同区域CSF-cNs可释放不同的神经递质，如尾加压素[29]、γ-氨基丁酸[7]、5-羟色胺[30]等。CSF-cNs通过分泌神经递质向大脑及脊髓动态传递信号，并调节神经系统的活动及发育。

4.2感知功能 CSF-cNs呈双极细胞形态，其树突可进入脑室系统，树突的末梢常有纤毛，这些带有纤毛的末端与已知的感知细胞相似，在细胞学上类似于化学感受器和机械感受器。Desban等[31]研究发现，CSF-cNs可感知脑脊液中pH值和渗透压的变化，以及脑脊液流量[32]或脊柱弯曲相关的机械刺激[33]。

4.2.1感知酸碱平衡酸碱平衡对于生物体的生存至关重要。研究表明，表达生长抑素/γ-氨基丁酸的CSF-cNs可感受细胞外pH值的双向偏离。Jalalvand等[34]将碱性和酸性的细胞外溶液应用于小鼠分离的脊髓，同时对CSF-cNs进行电流和电压钳记录。当细胞外液pH值降低或升高时，CSF-cNs中内向电流显著增加，应用ASIC3阻断剂APETx2(海藻毒素)后，阻断了对酸性的反应但不影响碱性反应。在碱性pH值下，他们记录了单一的内向电流，大小约为15 pA，与PKD2L1通道的大电导一致。根据不同pH值下对CSF-cNs细胞尖峰活性的记录发现，脊髓中CSF-cNs分别通过ASIC3和PKD2L1通道检测pH值的酸性和碱性偏差，导致动作电位的去极化和放电增加，并在pH值7.4附近呈U型反应[34]。为了研究下丘脑中CSF-cNs碱性pH值的通道类型，Jalalvand等[35]进行了PKD2L1的原位杂交(不存在特定PKD2L1的阻断剂)，结果发现下丘脑CSF-cNs并不表达PKD2L1，提示PKD2L1不是下丘脑CSF-cNs的碱性感受器。而连接蛋白半通道作为候选通道即使在没有与相邻细胞偶联的情况下也可以存在于CSF-cNs的细胞膜上，被认为是可以感知碱性pH值的候选分子。生长抑素阳性的下丘脑CSF-cNs对连接蛋白35/36呈免疫反应，应用阻断剂三氯化镧，可完全阻断CSF-cNs对碱性pH值的反应，表明下丘脑生长抑素阳性CSF-cNs的碱性反应是通过连接蛋白半通道介导。CSF-cNs这一功能可能代表了一种新的稳态机制，从而构成中枢神经系统固有的反馈调节系统，可能对pH值变化引起的损伤起保护作用。

4.2.2感知流体运动和光学信号 ASIC3除了在细胞外pH值适度降低时可被质子活化，还可以作为机械传感器，感知流体运动。感觉系统对于引导对称生长和运动回路的平衡激活至关重要，但它们也可能与形态发生有关。研究已证明，CSF-cNs能调节控制运动和主动姿势的脊髓回路[36]。有学者在斑马鱼幼体中发现，Reissner纤维与腹侧和背侧CSF-cNs的纤毛和微绒毛紧密相连，两者在功能上相互作用，以检测脊椎动物的脊柱弯曲[13,29]。此外，CSF-cNs也可作为光感受器发挥作用。下丘脑侧叶脑室旁器官中的CSF-cNs对光敏感，可能参与鸟类季节性繁殖的调节[37]。

4.3神经干细胞功能在低等脊椎动物中，脊髓中央管周围区域是神经发生的活跃部位，存在具有前体样细胞和未成熟神经元功能特性的细胞[38]。哺乳动物中，CSF-cNs在形态上是接触脑脊液最简单的神经元类型，其胞体位于室管膜或室管膜下，具有单个顶端投射的树突样突起[23]。新生小鼠中，它既可表达成熟神经元标志物也可表达未成熟神经元标志物[39-40]。因此，CSF-cNs在成熟哺乳动物发育过程中处于低分化状态，具有不成熟神经元特性，可能为内源性神经干细胞来源之一。基于以往关于CSF-cNs具有不成熟神经元特性及室管膜区存在多分化潜能的内源性神经干细胞的研究，He等[41]利用霍乱毒素亚单位B-皂苷靶向毁损CSF-cNs后发现，其可加速内源性神经干细胞的增殖，提示CSF-cNs对脊髓损伤后内源性神经干细胞增殖过程有一定影响；同时他们在体外培养CSF-cNs，利用其特异性标志物PKD2L1标记、鉴定CSF-cNs，发现PKD2L1+CSF-cNs不仅可在体外增殖，而且可以形成具有传代能力的神经球。Wang等[9]发现，CSF-cNs可在体外表达巢蛋白及转录因子性别决定区Y框蛋白2等神经干细胞标志物；贴壁诱导分化后，可在体外表达神经元核抗原、胶质纤维酸性蛋白、少突胶质细胞抗体等神经干细胞分化的标志物，说明CSF-cNs具有神经干细胞特征，可能参与脊髓损伤后的内源性修复。

4.4调节运动和信息传递研究显示，激活CSF-cNs可以诱导斑马鱼幼虫的运动，表明CSF-cNs可以为脊髓运动中心模式发生器提供直接输入[42]。研究发现，CSF-cNs和尾部初级运动神经元亚群之间存在直接联系[43]，CSF-cNs对慢速和快速运动中枢模式发生器进行门控和调节，从而控制运动事件的发生和持续时间。

Zhang等[44]通过电镜观察表明，中缝背核的CSF-cNs与脑实质的非CSF-cNs之间存在突触联系，形成轴-树突触或树-树突触，在信息传递中发挥重要作用。这些突触既有兴奋性也有抑制性突触，其共同特点是突触前成分均为非CSF-cNs的结构，突触后成分均为CSF-cNs的结构。在七鳃鳗中，CSF-cNs向腹侧神经丛或腹外侧缘发送神经突，在那里它们显示末梢结构的神经支配，这使得信息可以在内部和外部脑脊液之间传递[28,45]。七鳃鳗的CSF-cNs似乎在腹侧神经丛中接触到边缘细胞的脊髓内伸展感受器，这种感受器调节着运动神经网络[45]。这一研究表明，CSF-cNs可能通过影响边缘细胞来调节运动，从而影响运动相关的感觉反馈。

4.5参与疼痛信号转导脑干被公认为是整合下行调节系统的关键部位，下行调节系统抑制和促进脊髓水平的疼痛。远位CSF-cNs简称触液核，主要分布于导水管下部腹侧灰质和第四脑室底板上部腹侧灰质内。研究表明，触液核可能与疼痛信号的转导和调节密切相关，在不同疼痛条件下，触液核的c-Fos、5-羟色胺及受体、M8型瞬时受体电位通道和胞外信号调节激酶等10余种神经活性物质的表达可发生变化，但其具体机制尚不清楚[11]。Song等[6]将逆行示踪剂霍乱毒素亚单位B注射入大鼠标记触液核，证明CSF-cNs在大脑与脑脊液的联系中起关键作用，且触液核接受来自下丘脑室旁核、视上核、A11多巴胺细胞的输入并可能参与痛觉调制[46-49]。目前对于生物疼痛机制尚不清楚，触液核作为联系脑实质及脑脊液的纽带，在参与疼痛反应中发挥级联调节作用，其作用机制可能会为研究新型镇痛药提供新靶标。

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