分子标记辅助选择改良水稻不育系‘荃211S’白叶枯病的抗性

黄艳玲，严 志，申广勒，王 慧，张从合，杨 韦，陈 琳，张云虎，庞战士，乔 木，李方宝，杨 力

（安徽荃银高科种业股份有限公司/农业农村部杂交稻新品种创制重点实验室，合肥 230088）

0 引言

水稻是人类赖以生存的主要粮食作物之一，也是中国人口的主要口粮。随着全球气候变暖，化肥使用过量，水稻在生产过程中经常会受到各种病虫侵害，白叶枯病是其中最主要的病害之一，在世界很多国家各稻区均有发生。白叶枯病对水稻产量影响很大，苗期发生病害影响水稻植株营养生长；孕穗期发生病害造成水稻空瘪粒、茎秆变软、进而引起倒伏导致水稻严重减产，甚至颗粒无收。随着水稻白叶枯病的逐年加重，种植水稻的风险也越来越高。然而少量化学农药的使用对病害防治效果较差，过量农药又会造成环境污染。育种实践证明，选育和种植携带白叶枯病抗性基因的水稻品种是控制白叶枯病害发生的最经济和有效的方法。截至目前，至少定位了水稻白叶枯病抗性基因34个，其中10个基因成功克隆，大多数抗白叶枯基因来自栽培和野生种质资源[1]。

Xa23是迄今全球最广、抗性最强的抗白叶枯基因，该基因来源于普通野生稻，位于第11号染色体上，含有Xa23基因的品种其全生育期内高抗白叶枯病[2-3]。秦刚等[4]研究将Xa23基因导入籼稻、粳稻及不育系等不同遗传背景中，得出Xa23基因抗性遗传强，导入效应好，为选育高抗白叶枯病组合提供基因资源；夏志辉等[5]利用10个来源于菲律宾的白叶枯病菌株对明确含有抗白叶枯基因和高感白叶枯菌株进行鉴定，再次证明，Xa23基因抗谱最广、强度最强。目前，Xa23基因已广泛应用于水稻育种，杨德卫等[6]利用Xa23基因改良早稻恢复系‘东南恢012’，筛选出7份抗白叶枯的恢复系材料；李进波等[7]利用该基因改良了杂交亲本‘9311’和‘1826’白叶枯的抗性，从中筛选出恢复系‘C6201’、‘C6271’、‘C6351’；倪大虎等[8]利用分子标记辅助选择将抗稻瘟病Pi9基因和抗白叶枯Xa23基因聚合到同一优良株系获得携带双基因株系L10-L13；周鹏等[9]利用含有Xa23的恢复系‘R659’为抗性供体，异大穗型恢复系‘福恢2328’为受体，培育了2份含Xa23基因的纯合改良株系‘EMR402’、‘EMR403’；邓家团等[10]通过回交转育方法把Xa23基因快速导入新的恢复系材料中，使其高抗白叶枯且具有良好的恢复性及增产潜力；刘毅等[11]利用Xa23基因与‘沪旱1B’杂交、回交，提高了节水抗旱亲本白叶枯病抗性。上述导入Xa23基因的水稻材料白叶枯抗性均有不同程度的提高。

‘荃211S’系安徽荃银高科种业股份有限公司选育的特优良不育系，该不育系具有配合力高、易制种、好繁殖等优良特性；其所配组合高产、优质、抗倒、早熟、耐高温；目前，以‘荃211S’所配组合通过国家级、省级试验的品种较多，市场占有率高；唯一不足之处就是白叶枯抗性还有待提高。因此，本研究为了改良‘荃211S’抗白叶病的特性，通过常规育种与分子标记辅助选择技术相结合，将白叶枯病抗性基因Xa23导入‘荃211S’，选育出水稻白叶枯病抗性明显增强的4个改良的不育株系，以期培育出更多高产、优质、抗白叶病的杂交新组合。

1 材料与方法

1.1 试验地点

所有试验均在安徽荃银高科股份有限公司分子育种中心及三亚和合肥试验基地进行。

1.2 试验材料

以含有Xa23基因CBB23（高抗白叶枯）为供体亲本，以感白叶枯病两系不育系‘荃211S’为受体和回交亲本，通过杂交、自交等常规育种技术结合分子标记辅助选择技术改良‘荃211S’白叶枯病的抗性。

1.3 供试菌种

7个流行中国治病型白叶枯小种的病菌C1-C7由中国农业科学院提供；安徽省流行白叶枯病菌由安徽省农科院植物保护研究所提供。

1.4 分子标记辅助选择

DNA提取采用SDS法，PCR扩增引物选择与Xa23基因紧密连锁的标记RM206，序列为P1：5’-CCCATGCGTTTAACTATTCT-3’，P2：5’-CGTTCCAT CGATCCGTATGG-3’。PCR扩增方法参照NY/T1433-2014《水稻品种鉴定技术规程SSR标记法》，稍作调整。

1.5 白叶枯鉴定方法

白叶枯病的接种鉴定方法参照国家标准GB/T28078-2011《水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌检疫鉴定方法》[12]，鉴定的水稻材料播种于育秧盘，3次随机重复，育秧苗长至3～4叶期进行接种；经过大田常规育秧移栽，3次随机重复，分蘖盛期进行接种。接种方法：用剪刀蘸取5×108/mL的白叶枯病菌液，叶尖剪去1～2 cm，每株剪3片叶，每重复接种10株，接种后21天，测量10张叶片的病斑长度，同时测量接菌叶片的平均长度，并根据病斑长度划分病情指数和抗性类型（表1）。

表1 水稻白叶枯病病情分级标准及抗性类型的划分

1.6 改良‘荃211S’株系的育性

改良‘荃211S’的4个不育株系、‘荃211S’分别于2018年5月1日至6月10日播种，每10天播1期，共播种5期。始穗后每2天进行一次花粉镜检，每个不育系随机选取10穗，用镊子从穗的上、中、下部分别取一枚颖花的花药，放入已滴有一滴1%KI-I2溶液载玻片进行染色，并去除花粉囊，使花粉粒不重叠，在显微镜下观察；同时每天套袋5穗，记录花粉败育程度和套袋自交率。

1.7 改良‘荃211S’株系农艺性状的鉴定

2018年5月，对‘荃211S’和改良‘荃211S’的4个不育株系进行播种，栽插。并于抽穗期调查主要的农艺性状如：播始历期、柱头外露率等；10月份，进行室内考种，主要考察：株高、穗长、每穴穗数、每穗颖花数等。

1.8 改良‘荃211S’株系所配组合农艺性状的鉴定

2019年5月，‘荃211S’及其改良‘荃211S’的4个株系分别与‘9311’（感白叶枯）进行杂交。所得的杂交组合与‘丰两优4号’进行比较试验，种植规格为16.67 cm×26.67 cm，3次重复。10月份对所配的杂交组合进行农艺性状（株高、株型等）和丰产性状（有效穗数，每穗总花数、结实率、千粒重等）的考察。

1.9 统计方法

采用DPS对试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 利用分子标记辅助选择与传统育种技术相结合改良‘荃211S’的选育过程

利用与抗白叶枯病目标基因Xa23紧密连锁的分子标记RM206，对供体亲本‘CBB23’和受体亲本‘荃211S’进行PCR扩增分析，结果扩增出2条不同片段（图1）。

图1 RM206在供体亲本和受体亲本之间的多态性分析

2014年6月，以感病的‘荃211S’为受体亲本和轮回亲本，以含Xa23抗病基因的‘CBB23’为供体亲本进行杂交、自交；同时利用分子标记跟踪抗病基因Xa23，并通过人工接种筛选抗白叶枯病的单株系，最终选育出综合农艺性状好、不育系的育性转换温度低、白叶枯病抗性好的4个改良株系（QK211S-1、QK211S-2、QK211S-3、QK211S-4）。随机选取改良‘荃211S’的4个单株系进行分子标记检测，均为阳性纯合（图2）。不育系‘荃211S’改良选育过程（图3）。

图2 含Xa23基因纯合株系QK211S-1～QK211S-4的PCR分析

图3 不育系‘荃211S’改良选育过程

2.2 改良‘荃211S’株系抗性鉴定结果

为了鉴定改良不育系‘荃211S’对白叶枯病的抗性，本研究采用7个有代表性的中国白叶枯病菌株和安徽省流行的白叶枯病菌株对供体亲本‘CBB23’和受体亲本‘荃211S’及4个改良‘荃211S’株系在抽穗期进行白叶枯病接种鉴定（见表2与图4）。供体亲本‘CBB23’表现出高抗或抗，抗性级别为0-1；改良‘荃211S’也表现出高抗或抗，抗性级别为0-2；‘荃211S’对HLJ72、ZH173、GD1358、LN57、JS49-6均表现出中感，抗性级别为5-6，其他3个菌株表现出感，抗性级别为7，结果表明所选育的4个改良‘荃211S’株系白叶枯病抗性较‘荃211S’明显增强。

表2 ‘CBB23’、‘荃211S’及改良株系QK211S-1～QK211S-4对白叶枯病小种的抗性

图4 ‘CBB23’、‘荃211S’及改良株系QK211S-1～QK211S-4的对白叶枯病抗性比较

2.3 改良‘荃211S’株系的田间育性鉴定

为了鉴定考察改良不育系的育性，2018年5月1日，改良‘荃211S’的4个株系和‘荃211S’进行分期播种，每10天播种1期，共5期。抽穗时对其进行育性观测，每隔1天进行一次花粉镜检，同时每天套袋5穗，观察花粉败育程度和套袋自交率，并记录每天平均温度。鉴定结果：改良‘荃211S’的4个株系与‘荃211S’在合肥的不育期超过30天，日平均温度高于23.5℃花粉镜检结果为少量典败，套袋自交率为0，当平均温度降低到23.5℃以下超过3天时，15天后取刚出的小穗进行花粉镜检，花粉镜检结果多为染败，少量可育花粉粒，表明育性在23.5℃以下时发生转育。由此可见，4个改良不育株系与‘荃211S’的不育系育性稳定，育性起点温度在23.5℃。

2.4 改良‘荃211S’株系与‘荃211S’主要农艺性状的比较

改良‘荃211S’的4个株系播始历期较亲本‘荃211S’长1.39%～2.01%之外，差异达显著水平，其他农艺性状似‘荃211S’，详见表3。

表3 ‘荃211S’与改良株系QK211S-1～QK211S-4农艺性状的比较

‘荃211S’2019年3月，为考察改良‘荃211S’株系的配组情况，将改良‘荃211S’的4个株系、‘荃211S’分别与恢复系‘9311’进行杂交，杂交组合的主要农艺性状以及白叶枯抗病指数和抗病类型的比较见表4。‘荃211S’与‘9311’所配组合和改良‘荃211S’的4个株系与‘9311’所配组合在株高、有效穗、结实率、千粒重上均无明显差异；改良‘荃211S’的4个株系与‘9311’所配组合理论产量较‘荃211S’与‘9311’所配组合增产0.09%～0.34%，但无明显差异。

表4 ‘荃211S’、改良株系QK211S-1～QK211S-4所配组合与‘丰两优4号’农艺性状及白叶枯病鉴定的比较

续表4

改良‘荃211S’的4个株系与‘9311’所配组合在株高、每穗总粒数上显著或极显著低于‘丰两优4号’(ck)；而改良‘荃211S’的4个株系与‘9311’所配组合较‘丰两优4号’的有效穗显著增加4.21%～4.91%，结实率显著增加2.45-2.63%；改良‘荃211S’的4个株系与‘9311’所配组合理论产量较‘丰两优4号’增产4.24%～4.50%，差异达显著水平。

‘荃211S’与‘9311’所配组合和‘丰两优4号’(ck)抗白叶枯病的级别分别为7级和5级，为感病品种；而改良‘荃211S’的4个株系与‘9311’所配组合的白叶枯抗性级别均为1，为抗性品种，抗性较‘荃211S’明显增强。

3 讨论与结论

抗病品种的应用是农作物病害综合治理的重要途径之一，选育抗病品种是关键。近年来，随着分子标记辅助选择技术的日益成熟，国内开展了大量利用分子标记辅助选育抗白叶枯病水稻新品种的研究[2-11]。罗彦长等[13]将抗白叶枯基因Xa23及Xa21导入三系不育系‘R106A’，提高白叶枯病抗性的同时拓宽了亲本抗谱；郑康乐等[14]证实将多个单抗性基因聚合，可以明显增强被改良品种的白叶枯病抗性；赵天龙等[15]将抗白叶枯Xa23及Xa21导入‘明恢86’，再次证明聚合多基因白叶枯病抗性明显增强；倪大虎等[16]聚合抗稻瘟病pi9和抗白叶枯Xa23及Xa21基因，选育出既抗白叶枯病又抗稻瘟病的株系；陈志伟等[17]利用优质不育系‘Y58S’、‘RGD-S’与含有Pi-2、Pi-1、Pi-kh、Xa23及Xa21的保持系‘M215B’杂交、复交，选育出抗稻瘟病和白叶枯病新的两系不育系‘禾9S’；陈建民等[18]将水稻材料‘C750’中的白叶枯病基因Xa23基因和抗稻瘟病基因Pi9导入感病恢复系‘闽恢3139’中，使改良的‘闽恢3139’恢复系抗性和抗谱明显增强；徐建龙等[19]以抗白叶枯病‘早粳G38’和‘秀水11’杂交，选育出聚合xa5和Xa3的3个晚粳品系，其抗性水平明显强于双亲，抗谱也明显拓宽，本研究以含有抗白叶枯病Xa23基因的‘CBB2’体亲本导入异交结实率高的优质两系光温敏核‘荃211S’，提高了‘荃211S’白叶枯病抗性，这与罗彦长等[13]、郑康乐等[14]、赵天龙等[15]研究结果一致。上述研究聚合抗病基因，拓宽抗谱，提高抗病能力，延长品种的生命周期。

然而，由于品种的抗病性受温度、湿度、栽培措施、地形地貌以及病菌生理小种变异的影响，各稻区主栽品种由于是主基因和寡基因控制的抗病品种，推广若干年后，其抗性便丧失。辜琼瑶等[20]认为生态条件差异较大，形成不同致病种群，因而品种抗性丧失。为了使品种的抗病性稳定、持久，就需要不断挖掘抗性资源。多系品种或混合品种群体内抗性资源的多样性，不但增加品种对多种病菌小种的抗性，而且可以控制病原菌的发展和致病性的变异，从而延长品种的抗性[21]。

本研究以含有Xa23基因‘CBB23’为供体亲本，以不育系‘荃211S’为受体亲本和回交亲本，通过杂交、自交、等常规育种技术结合分子标记辅助技术，最终获得了4个白叶枯病抗性改良的不育系，抗性鉴定级别为0-2，属高抗或抗白叶枯病，抗性明显增强；‘荃211S’鉴定抗性级别为5-7，属中感或感白叶枯病。改良‘荃211S’株系所配组合白叶枯病的抗性级别为1，抗性明显增强。改良‘荃211S’株系在合肥不育的天数超过30天，花粉彻底败育，自交结实率为0，育性转换温度约在23.5℃，异交结实高，制种产量高且安全系数高。改良‘荃211S’株系与恢复系所配组合抗白叶枯的特性明显增强，抗性级别为1；改良‘荃211S’株系与恢复系所配组合较‘丰两优4号’的产量显著提高4.24%～4.50%。本研究改良了两系不育系‘荃211S’不抗白叶枯的特性，减少了大田生产风险，提高了其抵御白叶枯病害的能力。所获得的具有Xa23基因的4个改良株系白叶枯病抗性与所用供体亲本‘CBB23’抗性无明显差异，改良的4个‘荃211S’的株系同‘荃211S’农艺性状相当，白叶枯病的抗性明显增强，可以直接在生产中应用。