miR-181a靶向PTEN/PI3K/Akt信号通路调控宫颈癌细胞恶性生物学行为

杨洋梁萍陈昌益

广西壮族自治区人民医院 妇科,南宁530021

宫颈癌是女性最常见恶性肿瘤之一,近年来发病年龄呈年轻化趋势。尽管宫颈癌是可预防的恶性肿瘤之一,但新发病例数不断增加,尤其在我国缺乏有效筛查和规范治疗的偏远地区,宫颈癌仍是危害女性身心健康的重要公共卫生问题[1]。目前临床主要通过手术和放化疗等手段治疗宫颈癌,患者总生存率得到有效提高,但对于晚期宫颈癌患者,尤其是出现转移的患者,其5年生存率仍较低。宫颈癌细胞无限增殖及向远处转移仍是制约临床预后的关键因素。进一步阐明宫颈癌发生发展分子机制,寻求理想治疗方式,已成为临床亟待解决的问题。研究[2-3]显示,微小核糖核酸(microRNA,miRNA),如miR-34b、miR-586、miR-622等,与宫颈癌发生发展过程密切相关。miR-181a定位于人9号染色体,属于miR-181家族成员,在细胞生长及分化过程中发挥重要作用,广泛参与恶性胶质细胞瘤、急性淋巴细胞白血病等多种肿瘤进展过程[4-5]。研究[6]显示,miR-181a在卵巢癌患者中表达是对照人群的20.62倍,参与卵巢癌进展,并与肿瘤分期等临床特征相关,可作为潜在治疗靶点。研究[7]表明,miR-181a可促进子宫内膜癌细胞增殖和迁移。miR-181a在妇科肿瘤中发挥重要作用,而其在宫颈癌中的作用及相关机制尚不明确。本研究观察miR-181 对宫颈癌细胞恶性生物学行为的影响,并探讨相关作用机制,旨在为临床治疗宫颈癌提供新的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞系

人宫颈癌SiHa细胞,购自中国科学院上海细胞库。

1.2 主要试剂和仪器

LipofectamineTM2000试剂盒(美国Invitrogen公司),含有miR-181a拟似物(mimic)及拟似物阴性对照(mimic-NC)、抑制剂(inhibitor)及抑制剂阴性对照(inhibitor-NC)的pc DNA3.1重组质粒(上海吉玛制药技术有限公司);MTT 试剂盒(北京索莱宝科技有限公司),Transwell小室(美国Corning公司),荧光素酶检测试剂盒(美国Promega公司),兔抗人第10 号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10,PTEN)、磷酸肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、p-Akt一抗及HRP 标记的山羊抗兔二抗(美国Abcam 公司)。Gallios流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司),7500荧光定量PCR仪(美国Thermo Fisher公司),DYY-6C电泳仪(北京六一生物科技有限公司)。

1.3 细胞培养

37℃水浴复苏Si Ha细胞,接种于DMEM 培养基中(其中含有质量分数为10%的胎牛血清、1%的青霉素和链霉素),置于CO2饱和湿度培养箱中(其中含有质量分数为5%的CO2),37 ℃条件下培养,取对数期生长良好细胞用于以下实验。

1.4 细胞转染及分组

转染前24 h,重悬细胞密度为1×106个/m L,接种于6孔板,待细胞生长至80%融合度时进行转染。将细胞随机分为空白对照组、拟似物组和拟似物对照组、抑制剂组和抑制剂对照组。空白对照组不转染,其他4 组进行转染:分别取5μL LipofectamineTM2000和含有miR-181a mimic、miR-181a mimic-NC、miR-181a inhibitor和miR-181a inhibitor-NC 序列的质粒,加入250μL Opti-MEM©,均匀混合,孵育5 min;将稀释的LipofectamineTM2000和含有各序列的质粒在室温下混合,孵育20 min,制备质粒脂质体复合物;将质粒脂质体复合物加入到6孔板中,轻摇混合进行转染。

1.5 MTT法检测各组细胞增殖能力

将各组细胞使用胰酶消化,PBS 洗涤,重悬细胞密度为1×105个/m L,接种于96孔板;置于质量分数为5% 的CO2培养箱,37 ℃培养24 h、48 h和72 h;除去上清,加入新鲜培养基,同时每孔加入10 μL MTT 溶液,继续培养4 h;弃上清,每孔加入150 μL二甲基亚砜,低速摇晃10 min,充分溶解结晶后,使用酶标仪读取490 nm 处吸光度A。

1.6 流式细胞术检测各组细胞凋亡率

胰酶消化各组细胞,3 000 r/min室温离心5 min,1×缓冲结合液重悬细胞密度为1×106个/mL;加入1.25μL Annexin V-FITC于室温条件下避光孵育15 min,离心弃上清,PBS洗涤,使用1×缓冲结合液重悬细胞;加入10μL PI染色液,室温避光染色10 min,离心弃上清,PBS洗涤;加入400μL的1×缓冲结合液,使用流式细胞仪检测细胞凋亡率。细胞凋亡率=[(早期凋亡细胞+晚期凋亡细胞)/细胞总数]×100%。

1.7 Transwell实验检测各组细胞侵袭能力

按1∶50的比例稀释Matrigel胶,每个小室添加200μL稀释后的Matrigel胶;将Transwell小室放置在24孔板中,置于质量分数为5% 的CO2培养箱中,37 ℃过夜。取各组细胞,PBS清洗,用不含血清的DMEM 培养液重悬细胞,调整细胞密度为1×106个/m L;取出小室,上室加入200μL 细胞悬液,下室加入600μL含有质量分数为10%胎牛血清的DMEM 培养基,继续放入质量分数为5% 的CO2培养箱中,37 ℃培养48 h;取出小室,将膜表面的细胞和胶擦去,放入甲醇中固定20 min后,用质量分数为0.1%的结晶紫室温染色30 min,清水冲洗;晾干后显微镜下拍照,随机取5 个视野,用Image Pro Plus软件对穿膜细胞进行计数。

1.8 RT-qPCR 检测各组细胞miR-181a、PTEN mRNA表达水平

提取各组细胞总RNA,严格按照TRizol说明书步骤进行操作。紫外分光光度计检测260 nm 和280 nm 处吸光度A,计算两者比值,确定RNA 浓度及纯度;参照反转录试剂盒说明书,得到反转录产物cDNA,进行实时定量荧光PCR;根据引物设计原则,应用Primer 5.0设计引物。所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成,引物序列见表1。反应体系:2μL cDNA 模板,10μL SYBR Green Mix(2×),0.5μL PCR Forward Primer,0.5 PCR Reverse Primer,dd H2O 补充总体积至20μL。扩增条件:95 ℃10 min,95 ℃10 s,55 ℃60 s,72 ℃30s,共40个循环。miR-181a以U6为内参,PTEN以GAPDH 为内参,采用公式2-△△CT计算miR-181a、PTEN m RNA 表达水平。

表1 引物序列

1.9 双荧光素酶实验验证miR-181a与PTEN 的靶向关系

利用TargetScan 和miRanda软件预测miR-181a的潜在靶基因,将PTEN 的3′UTR 区域野生型(wt)和突变型(mut)核苷酸序列分别构建至Firefly-Luciferase报告基因。取对数期Si Ha细胞,按1×106个/m L接种于6孔板;待细胞铺满约50%时,将wt PTEN 和mut PTEN 质粒载体分别与miR-181a mimic/miR-181a mimic-NC及miR-181a inhibitor/miR-181a inhibitor-NC共转染至SiHa细胞;继续培养48 h,检测萤火虫荧光素酶活性和海肾荧光素酶活性,相对荧光素酶活性以二者比值表示。

1.10 Western blot法检测各组细胞蛋白表达

PBS清洗各组细胞,1 500 r/min离心3 min,弃上清;加入细胞裂解液,12 000 r/min,抽提总蛋白。BCA 法测定蛋白浓度,配制分离胶和浓缩胶。根据蛋白样品浓度,每孔加入30μg 样品,进行SDS-PAGE凝胶电泳;湿转法将胶上的蛋白转移至PVDF 膜,放入5%脱脂牛奶中,室温封闭2 h;TBST 溶液洗膜5 min×3次,加入一抗4 ℃,过夜;TBST 溶液洗膜5 min×3次,加入相应二抗,室温孵育2 h。TBST 溶液洗膜5 min×3次,ECL显色,显影、拍摄;分析条带,计算目的蛋白相对表达水平。目的蛋白相对表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参GDPAH 条带灰度值。

1.11 统计学处理

实验数据采用SPSS 25.0软件进行分析,计量资料表示为,多样本比较以单因素方差分析,进一步两两比较以LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞增殖能力比较

与空白对照组、拟似物对照组比较,拟似物组细胞24 h、48 h、72 h的A值增加(P<0.05);与空白对照组、抑制剂对照组比较,抑制剂组细胞24 h、48 h、72 h的A值减小(P<0.05);抑制剂组细胞24 h、48 h、72 h的A值小于拟似物组(P<0.05)。空白对照组与拟似物对照组、抑制剂对照组的细胞各时间点A值比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

图1 各组细胞增殖能力比较

2.2 各组细胞凋亡率比较

与空白对照组、拟似物对照组比较,拟似物组细胞凋亡率降低(P<0.05);与空白对照组、抑制剂对照组比较,抑制剂组细胞凋亡率升高(P<0.05);抑制剂组细胞凋亡率高于拟似物组(P<0.05)。空白对照组与拟似物对照组、抑制剂对照组的细胞凋亡率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表2、图2。

表2 各组细胞凋亡率比较

图2 流式细胞术检测各组细胞凋亡率

2.3 各组细胞侵袭数比较

与空白对照组、拟似物对照组比较,拟似物组侵袭细胞数增加(P<0.05);与空白对照组、抑制剂对照组比较,抑制剂组侵袭细胞数减少(P<0.05),抑制剂组侵袭细胞数少于拟似物组(P<0.05)。空白对照组与拟似物对照组、抑制剂对照组的侵袭细胞数比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表3、图3。

图3 Transwell实验检测各组侵袭细胞数

表3 各组侵袭细胞数比较

2.4 各组细胞miR-181a、PTEN mRNA表达比较

与空白对照组、拟似物对照组比较,拟似物组miR-181a表达升高,PTEN mRNA 表达降低(P<0.05);与空白对照组和抑制剂对照组比较,抑制剂组miR-181a表达降低,PTEN m RNA 表达升高(P<0.05);抑制剂组miR-181a表达低于拟似物组,PTEN m RNA 表达高于拟似物组(P<0.05)。空白对照组与拟似物对照组和抑制剂对照组的miR-181a、PTEN m RNA 表达比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见图4。

图4 各组细胞miR-181a、PTEN mRNA表达水平

2.5 双荧光素酶结果

miR-181a与PTEN 存在连续结合位点,见图5A。转染miR-181a mimic可明显抑制wt PTEN相对荧光素酶活性,转染miR-181a inhibitor可明显升高wt CPTEN 相对荧光素酶活性(P<0.05),见图5B;转染miR-181a mimic和miR-181 a inhibitor对mut PTEN 相对荧光素酶活性无明显影响(P>0.05),见图5C。

图5 miR-181a靶向PTEN

2.6 各组细胞相关蛋白表达比较

与空白对照组、拟似物对照组比较,拟似物组PTEN 蛋白表达降低,PI3K、p-Akt蛋白表达升高(P<0.05);与空白对照组、抑制剂对照组比较,抑制剂组PTEN 蛋白表达升高,PI3K、p-Akt蛋白表达降低(P<0.05);抑制剂组PTEN 蛋白表达高于拟似物组,PI3K、p-Akt蛋白表达低于拟似物组(P<0.05)。空白对照组与拟似物对照组、抑制剂对照组的PTEN、PI3K、p-Akt蛋白表达比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表4、图6。

表4 各组相关蛋白表达水平比较()

表4 各组相关蛋白表达水平比较()

a 与空白对照组比较,P<0.05;b 与相应对照组比较,P<0.05;c 与拟似物组比较,P<0.05。

图6 各组细胞蛋白表达电泳图

3 讨论

宫颈癌严重威胁女性生命健康,由子宫颈鳞状上皮经过低级别病变、高级别病变、早期浸润癌等阶段,最终进展为浸润癌。宫颈癌的发生与遗传、多产、性活跃等多种因素有关,其中人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)感染是引起宫颈癌的主要危险因素,尤其是高危型HPV 持续感染,90%以上患者由高危型HPV 持续感染引起[8]。miRNA在宫颈癌发生发展过程中发挥重要作用,某些异常表达的miRNA 可作为宫颈癌诊断、预后潜在标志物和治疗靶点,为临床靶向治疗宫颈癌提供新思路[9-10]。

miRNA 参与调控细胞增殖、凋亡、分化等多种生物学行为过程,是肿瘤发生发展过程中的关键分子。miR-181a失调与人类多种肿瘤密切相关,在不同种类肿瘤中表达水平不尽相同。研究[11]显示,miR-181a可增加髓系来源抑制细胞原位浸润,促进乳腺癌肿瘤生长和免疫逃逸。Luo等[12]对几种人类宫颈癌细胞系中miR-181a的表达进行评估,结果显示:不同细胞系中miR-181a表达存在差异,与细胞增殖及治疗敏感性有关。而在卵巢癌患者中,高表达miRNA-181a与治疗不良反应及早期进展密切相关[13]。本研究以宫颈癌Si Ha细胞为研究对象,通过转染miR-181a拟似物和抑制剂,观察miR-181a对细胞的影响,结果显示:转染miR-181amimc的细胞增殖能力升高、凋亡率降低、侵袭细胞数增加,而细胞转染miR-181a inhibitor后呈现相反效果。提示miR-181a参与调节宫颈癌细胞增殖、凋亡和侵袭过程,上调其表达可促进细胞增殖和侵袭,抑制细胞凋亡,发挥促癌作用。

PTEN/PI3K/Akt信号通路在诱导肿瘤细胞凋亡、调节细胞周期方面发挥重要作用,与多种肿瘤发展过程有关。PTEN 是一种抑癌基因,在正常组织中均有表达,而在膀胱癌、子宫内膜癌等恶性肿瘤中表达降低[14-15]。动物实验[16]证实,敲除PTEN 基因的小鼠,可导致前列腺癌。临床研究[17]显示,宫颈癌患者中PTEN 明显缺失,并与肿瘤分期、肿瘤大小、病理学分期以及淋巴结转移显著相关。PI3K 是磷脂激酶家族重要成员,可激活Akt,促进细胞过度增殖,发生癌变。多项研究[18]表明,PTEN 和PI3K在恶性肿瘤中呈负相关,PTEN 可通过脱磷酸作用阻断PI3K,拮抗Akt,抑制细胞增殖,并诱导细胞凋亡,是PI3K/Akt通路关键抑制剂。本研究结果显示:转染miR-181a mimic后,细胞中PTEN mRNA表达明显下降,而转染miR-181a inhibitor 后,PTEN m RNA 表达明显升高。提示miR-181a可能参与调节PTEN 表达。进一步Western blot实验结果显示:拟似物组PTEN 蛋白表达明显下降,PI3K、p-Akt蛋白表达明显升高,抑制剂组上述蛋白表达呈相反结果。经荧光素酶实验证实,PTEN 是miR-181a直接靶基因,表明miR-181a可靶向抑制PTEN 表达,调控PI3K/Akt 通路。Nishimura等[19]证实,高表达miR-181a在大肠癌中通过抑制PTEN,影响患者预后,与本研究结果相似。提示miR-181a可靶向PTEN/PI3K/Akt,影响宫颈癌细胞增殖和凋亡。

综上所述,本研究发现过表达miR-181a可促进宫颈癌Si Ha细胞增殖和侵袭,抑制细胞凋亡,部分原因可能与靶向抑制PTEN 表达、进而调控PI3K/Akt通路有关。敲降miR-181a可能是治疗宫颈癌的潜在靶标,但其是否存在其他作用机制,尚需进一步研究明确。