白术与菊科混伪品的鉴别研究*

李子璐，余国鑫，陈 君

中国药科大学 中药学院生药学系，南京210009

中药白术为菊科植物白术Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根茎，性温，味苦、甘[1，2]，具有健脾益气、燥湿利水、止汗、安胎的功效[3-9]，用于治疗脾虚、腹泻、水肿、胎动不安等多种疾病。白术广泛产于全国各地，市场以栽培品为主[10-13]。其近缘的混伪品主要有北苍术、茅苍术、菊三七、木香、土木香、关苍术等[14]，因混伪品的掺杂，影响药材的使用与临床疗效，所以有必要建立直观、全面的白术质量控制方法。性状鉴别、显微鉴别为两种传统的中药材鉴别手段，具有易行、简便和快速的特点，是常用的中药材检验方法。指纹图谱作为中药材质量控制的有效手段之一，可将药材信息综合量化，直观并多层次地反映药材主要成分等，为药材质量控制提供更全面的信息[15]。

本研究首先对白术基源进行鉴定，其次建立白术高效液相色谱指纹图谱并对其进行相似度评价，比较不同批次白术之间的差异，通过与混伪品对比实现白术的鉴别，为白术的质量控制与评价提供相关依据。

1 仪器、试剂与材料

1.1 仪器与试剂

E100 显微成像系统（日本尼康公司）；LC-20A高效液相色谱系统（日本岛津公司）；超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用系统（Agilent 1290 UHPLC-6530 Q/TOF MS，美国Agilent）；十万分之一电子天平（中国梅特勒-托利多仪器有限公司）。

磷酸、乙醇、甲醇、乙腈为色谱纯；水为超纯水。

1.2 材料

对照品：苍术酮（atractylone）、白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（atractylenolide Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ）购于成都曼思特生物科技有限公司（纯度＞98%）。从市场上收集白术药材20 批，经本文作者陈君鉴定为菊科植物白术Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根茎；收集白术的近缘混伪品，经陈君鉴定分别为：木香（Aucklandia lappa Decne.）、菊三七（Gynura japonica（Thunb.）Juel.）、北苍术（Atractylodes chinensis（DC.）Koidz.）、茅苍术（Atractylodes lancea（Thunb.）DC.）、关苍术（Atractylodes japonica Koidz.ex Kitam.）、土木香（Inula helenium L.）。

不同编号药材的购买地：S1～S7 白术为浙江；S8～S14 白术为安徽；S15～S20 白术为河北。S21 关苍术为黑龙江；S22 菊三七为湖北；S23 木香为四川；S24 土木香为河北；S25 茅苍术为山西；S26 北苍术为内蒙古。

2 方 法

2.1 药材鉴别

2.1.1 性状鉴别 观察药材形态，断面的颜色、质地、油点以及气味等特征。

2.1.2 显微鉴别 药材粉碎，过四号筛，取少量药材粉末，水合氯醛溶液加热透化，甘油酒精装片，镜检，观察粉末显微特征。

2.2 指纹图谱研究

2.2.1 对照品溶液的制备 分别精密称取一定量的苍术酮、白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ对照品于50 mL 量瓶中，用甲醇溶解定容，摇匀，配制成各对照品储备液。分别精密吸取各对照品储备液2 mL 于同一10 mL 量瓶中，加甲醇定容，摇匀，配制成苍术酮、白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ浓度分别为0.028、0.020、0.034、0.020 mg·mL-1的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密称定白术粗粉1.0 g，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇25 mL，称重，超声30 min（250 W，30 kHz，35 ℃），取出，放冷，用甲醇补足失重，摇匀，离心（13000 r·min-1）10 min，取上清液，0.45 μm 微孔滤膜过滤，得供试品溶液。

2.2.3 色谱条件 色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18（4.6×250 mm，5 μm）；流动相：0.05%磷酸（A 相）-乙腈（B 相），梯度洗脱（洗脱程序：0～7 min，5%～13%B；7～12 min，13%～23%B；12～25 min，23%～50%B；25～30 min，50%～62% B；30～45 min，62%～70% B；45～49 min，70%～90%B；49～60 min，90～100%B；60～65 min，100%B）；柱温：25 ℃；检测波长：232 nm；流速：1 mL·min-1；进样体积：10 μL。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液，按“2.2.3”色谱条件连续进样测定6 次，考察各共有峰峰面积和保留时间的一致性。各共有峰保留时间RSD＜1%，峰面积RSD＜2%，说明仪器精密度良好。

2.3.2 重现性试验 按“2.2.2”项下方法平行制备供试品溶液6 份，按“2.2.3”色谱条件分别进样测定，考察各共有峰峰面积和保留时间的一致性。各共有峰保留时间RSD＜1%，峰面积RSD＜2%，表明方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液适量，按“2.2.3”色谱条件于第0、4、8、12、24、48 h 不同时间点进样测定，考察各共有峰峰面积和保留时间的一致性。各共有峰保留时间RSD＜2%，峰面积RSD＜2%，说明供试品溶液在48 h 内稳定性良好。

3 结果与分析

3.1 白术及其混伪品的性状鉴别

白术呈不规则肥厚团块状，表面具瘤状突起，质地坚实不易折断，断面不平坦，呈黄白色至淡棕色，有棕黄色的点状油室散在，气清香。茅苍术、北苍术、关苍术表面均无瘤状突起；茅苍术断面有多数橙黄色或棕红色油室，久储会析出白毛状结晶；北苍术质地疏松，香气较淡；菊三七断面存在凸起的筋脉纹，菊花心明显；木香表面无瘤状突起，气特异；土木香表面无瘤状突起，呈圆锥状，断面略平坦。经上述观察，白术与混伪品可被鉴别区分。见图1。

图1 白术及其混伪品药材图

3.2 白术及其混伪品的显微鉴别

经观察比较，可以通过石细胞的大小与数量、纤维形态、油室多寡、菊糖纹理、有无草酸钙针晶等特征来区分白术与几种混伪品。白术粉末中草酸钙针晶细小，存在于薄壁细胞；纤维稀少，呈长梭形，壁甚厚，孔沟及胞腔明显；石细胞多，常单个散在；菊糖表面呈放射状纹理；导管分子短小，为网纹导管及具缘纹孔导管；油室碎片较少。北苍术粉末中石细胞甚多，常成群；纤维短棒状，末端钝圆；油室碎片多且易见；菊糖表面呈放射状纹理。茅苍术粉末中石细胞层纹明显；纤维长梭形，壁甚厚；油室碎片多且易见；菊糖多见，表面呈放射状纹理。关苍术石细胞较小；纤维末端钝圆或分叉；无菊糖。菊三七粉末中无石细胞及油室碎片；菊糖呈不规则块状，无放射状纹理。木香粉末中无石细胞；菊糖众多；表面呈放射状纹理。土木香粉末中含草酸钙方晶；无石细胞；菊糖呈不规则块状；表面无放射状纹理。通过显微鉴别白术与混伪品被明显区分，见图2。

图2 白术及其混伪品粉末显微图

3.3 白术指纹图谱的建立及相似性分析

使用国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012.130723 版）软件进行指纹图谱的构建及相似度评价，使用中位数法生成对照图谱，共匹配出10 个共有指纹峰（见图3）。通过与对照品比对共准确鉴定出4 个共有峰，分别为白术内酯Ⅲ（2）、白术内酯Ⅱ（5）、白术内酯Ⅰ（6）、苍术酮（9）。经超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱分析，根据碎片信息和相关文献推测鉴定出其它6 个共有峰，分别为对羟基苯甲酸辛酯（1）、2-（联苯基-4-基）乙醛（3）、3β-羟基苍术酮（4）、芹烷二烯酮（7）、邻苯二甲酸二丁酯（8）、4-（3-乙基-5-甲基-1-苯并呋喃-2-基）-2-丁酮（10）。9 号峰分离度最佳、峰面积较大，故选9 号峰作为参照峰（S峰），以参照峰为基准计算白术各共有峰相对保留时间的RSD＜1%，符合中药指纹图谱研究的技术要求；各共有峰相对峰面积的RSD 在11%～37%，差异较大，说明各批次药材中的成分含量存在波动，其质量存在差别。20 批药材与对照图谱的相似度在0.949～0.999（见表1）。

表1 药材指纹图谱相似度评价结果

图3 HPLC 色谱图（A）混合对照品；（B）白术样品

3.4 白术与其混伪品的指纹图谱对比分析

取北苍术、关苍术、菊三七、茅苍术、木香、土木香药材，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.3”项下色谱条件进样测定，将所得图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》 软件进行相似度比对。各混伪品与白术的相似度范围在0.018～0.513。如图4 所示，白术指纹图谱与混伪品的色谱图轮廓差异较大。其中，茅苍术、北苍术与白术的相似度较小，分别为0.277、0.261，表明两种苍术与白术的化学成分存在明显差异。关苍术与白术的相似度最大，为0.513，表明两者所含化学成分相对更接近。以上信息表明，古代典籍中统称为“术”的苍术和白术在固有成分上存在明显差别，本研究所建立的色谱方法能对其进行区分鉴别。而木香、土木香、菊三七与白术的相似度均在0.070 以下，与白术成分差异较大，所建立的指纹图谱方法可成功将其鉴别区分。

图4 白术与其混伪品HPLC 色谱图

4 讨论

本研究首先通过观察药材外观形态、断面质地、油点等性状特征，以及粉末中石细胞分布、油室多寡、菊糖纹理、纤维形态等显微特征，利用传统鉴别手段对白术及其混伪品进行了鉴定区分。

通过对白术提取条件的考察，最终选择以甲醇作为提取溶剂，料液比为1∶25，35 ℃超声提取30 min制备供试品溶液，该制备方法所用时间短且提取率高。在DAD 检测器条件下对白术样品进行了全波长扫描，发现在232 nm 处色谱图出峰更多且响应较好。对水-乙腈、0.05%磷酸-乙腈、水-甲醇、0.05%磷酸-甲醇等流动相系统进行了筛选，发现0.05%磷酸-乙腈作为流动相时各色谱峰分离度良好，最终确定了白术指纹图谱的色谱条件。

通过对20 批白术药材的分析，共匹配出10 个共有指纹峰构成HPLC 指纹图谱的特征峰。各混伪品与白术的相似度均较低，可与正品区分。所建指纹图谱显示，各批次白术药材共有峰的相对峰面积差异较大，说明各批次药材的质量存在差别。

本研究运用性状、显微鉴别传统手段较快地甄别了白术正品与混伪品；所建立的指纹图谱方法可直观、多层次地表现出白术与混伪品之间的差异；两者相辅相成为白术的质量控制与评价提供了相关依据。之后还可进一步与白术质量标志物的含量测定相结合，更准确、全面地反映白术的整体质量，为白术质量控制提供更为可靠的实验依据。