阿拉伯胶对薏米醇溶蛋白-虾青素纳米颗粒性质影响

谢灏婷， 张 霞， 丁玉琴， 刘妮娜， 张智忠， 夏 旭

(中南林业科技大学食品科学与工程学院1，长沙 410000) (怀化市农业科学研究所2，怀化 418000)

虾青素(Astaxanthin，ASX)，是一种天然的抗氧化物质[1]，其抗氧化活性是叶黄素的10倍，维生素E的100倍[2]。虾青素还具有抗炎性[3，4]、抗病能力和调控免疫相关基因表达[5]等生理活性。但由于虾青素水溶性差、不稳定且易氧化分解，生物利用率低而限制了其应用。通过构建纳米颗粒[6]、乳液[7]、脂质体及微胶囊[8]等递送体系荷载虾青素是提高虾青素的溶解性和稳定性的有效途径。

薏米含有约14.6%的蛋白质，其中醇溶蛋白约占薏米总蛋白质量的44.7%[9]。目前对薏米蛋白的研究主要集中在提取方法和分离蛋白的功能特性等[10，11]，对薏米蛋白尤其是薏米醇溶蛋白的应用研究还较少。薏米醇溶蛋白具有许多与玉米醇溶蛋白相似的理化性质，如消化性和水溶性差等。玉米醇溶蛋白[12]、小麦醇溶蛋白[13]、高粱醇溶蛋白等均可以通过反溶剂沉淀法制备纳米颗粒来作为疏水性活性物质的载体，因此，推测薏米醇溶蛋白可能也是一种潜在的疏水性活性物质输送载体。前期研究采用反溶剂法制备了荷载虾青素的醇溶蛋白纳米颗粒，但发现其在pH 6.0～7.0时易聚集并产生沉淀，稳定性较差。

阿拉伯胶是一种天然阴离子多糖，且具有良好的两亲性，被用于改善蛋白基纳米颗粒的稳定性[14]。因此，本研究采用静电沉积法将阿拉伯胶吸附到薏米醇溶蛋白-虾青素纳米颗粒上，制备薏米醇溶蛋白-虾青素-阿拉伯胶纳米颗粒，并进一步研究阿拉伯胶对薏米醇溶蛋白-虾青素纳米颗粒稳定性和抗氧化性的影响，为虾青素纳米输送体系的开发和薏米醇溶蛋白的高值化利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

薏仁米(贵州)；阿拉伯胶、正己烷、氢氧化钠、氯化钠、丙酮、无水乙醇、ABTS、DPPH，均为分析纯；虾青素(纯度>90%)；Viscozyme L酶。

R-5410高速离心机，RV10 digital旋转蒸发仪，UV-2100紫外分光光度计，ZetasizerNano ZS纳米粒度仪，Lab-1A-50E冷冻干燥机，D8 advance X射线衍射分析仪，FEI Tecnai G2扫描电镜。

1.2 方法

1.2.1 醇溶蛋白的提取

薏米醇溶蛋白的提取参考Liu等[15]的方法，并稍作修改。新鲜薏米磨粉过80目筛，采用正己烷脱脂，得到脱脂薏米粉。将脱脂薏米粉加入超纯水(pH 4.6，料液比为1∶10)中，按3.02 FBG/g的加酶量加入Viscozyme L酶，然后在44 ℃下酶解2.8 h后，8 000 r/min离心15 min取沉淀。按1∶12的比例往沉淀中加入体积分数75%的乙醇，55 ℃下水浴搅拌2 h，10 000 r/min离心15 min取上清液。按1∶1的比例往上清液中加入超纯水，并调pH至6.2，加入质量分数2%NaCl，静置12 h，5 000 r/min离心15 min，取沉淀，透析袋透析24 h，透析结束后水洗3次至pH呈中性。冷冻干燥得到薏米醇溶蛋白粉末。由凯氏定氮法测得薏米醇溶蛋白中蛋白质质量分数为89%。

1.2.2 醇溶蛋白-虾青素-阿拉伯胶纳米颗粒的制备

参考Dai等[16]的方法并稍作修改，0.3 g薏米醇溶蛋白溶于10 mL 体积分数75%乙醇，50 ℃下600 r/min磁力搅拌2 h使醇溶蛋白完全分散。配制0.15 mg/L的虾青素-丙酮溶液，然后将虾青素溶液与薏米醇溶蛋白溶液等体积混合均匀后，在600r/min下缓慢滴入5倍体积的去离子水(pH 3.5)中，搅拌均匀后旋转蒸发除去有机溶剂，然后离心(3 000 g，15 min)除去不溶性物质，得到薏米醇溶蛋白-虾青素纳米颗粒(C-ASX-NP)。取不同量阿拉伯胶使其与醇溶蛋白比例(AG∶C)分别为2∶1、1.5∶1、1∶1、1∶2、1∶3，溶于2 mL的超纯水中，以600 r/min磁力搅拌30 min使其完全溶解，再用1 mol/L HCl将阿拉伯胶溶液pH调至3.5。将薏米醇溶蛋白-虾青素纳米颗粒溶液加至不同浓度阿拉伯胶溶液中，得到薏米醇溶蛋白-虾青素-阿拉伯胶纳米颗粒溶液(C-ASX-AG-NP)。

1.2.3 薏米醇溶蛋白-虾青素-阿拉伯胶复合纳米颗粒的包埋率与荷载率

参考Jiang等[17]的方法并稍加修改，将制备好的C-ASX-AG-NP-20 ℃冷冻24 h，冷冻干燥机干燥48 h得到C-ASX-AG-NP冻干粉末。称取5 mg C-ASX-AG-NP冻干粉末至离心管中，加入5 mL无水乙醇，旋涡振荡器振荡30 s，加入5 mL正己烷，旋涡振荡器振荡1 min，振荡结束后加入5 mL水，继续振荡1 min，振荡结束后放入恒温振荡水浴锅振荡30 min以充分提取颗粒内的虾青素，振荡结束后800 g离心5 min，取上清液在472 nm处测定其吸光度A472 nm。用经验公式计算虾青素质量，用公式确定荷载率和包埋率：

式中：A472 nm为上层溶液的吸光度；V为加入乙醇的体积/mL；P为虾青素的分子量，597 g/mol；ε虾青素的摩尔吸收系数 ，125 100 L/(mol·cm)。

1.2.4 纳米颗粒的粒径与ζ-电位的测定

参考Donsì等[18]的方法，采用纳米粒度仪测定的C-ASX-NP和C-ASX-AG-NP溶液中颗粒的粒径和zeta电位，同时测定了纳米颗粒溶液的分散系数(PDI)。

1.2.5 纳米颗粒的稳定性研究

1.2.5.1 pH稳定性

将制备好的C-ASX-NP和C-ASX-AG-NP溶液pH分别调至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，测量粒径及电位。

1.2.5.2 盐离子稳定性

将新鲜制备的C-ASX-NP和C-ASX-AG-NP溶液与不同浓度的NaCl溶液等体积混合，使纳米颗粒与NaCl混合溶液的浓度分别为0、25、50、75、100、150 mmoL/L并测量粒径。

1.2.5.3 储藏稳定性

将新鲜制备的C-ASX-NP和C-ASX-AG-NP溶液分别放置于4 ℃和25 ℃环境下避光保存，分别在0、5、10、15 d时测量其粒径电位和虾青素保留率。虾青素保留率的测定按照方法1.2.3并稍作修改。取1 mL纳米颗粒溶液置于离心管中，加入5 mL无水乙醇，旋涡振荡器振荡30 s，混合均匀后加入5 mL正己烷，旋涡振荡器振荡1 min，结束后加入4 mL水，继续振荡1 min，结束后放入恒温振荡水浴锅振荡30 min以充分萃取颗粒内的虾青素，振荡结束后800 g离心5 min，取上清液在472 nm处测定其吸光度A472 nm。虾青素保留率计算公式为：

1.2.6 纳米颗粒的结构表征

1.2.6.1 X-射线衍射分析

用Cu靶和40 kV的电压，以2°/min的扫描速度扫描记录纳米颗粒冻干粉末的5°～45°的XRD图谱。

1.2.6.2 透射电镜

新鲜制备的纳米颗粒分散液用 pH 4的超纯水稀释 10倍，均匀混合后分别取一滴C-ASX-NP和C-ASX-AG-NP分散液滴在铜网上，在空气中自然干燥后进行拍摄。

1.2.7 抗氧化能力测定

1.2.7.1 ABTS+·清除能力测定

参考Meng等[19]的方法，将7.4 mmol/L的ABTS与2.6 mmol/L的过硫酸钾等体积混合，混合均匀后室温下避光静置16 h，使用前用10 mmol/L的磷酸盐缓冲液稀释约50倍，在734 nm处测量其吸光度，其为(0.7±0.02)。将16 μL分别稀释至5、10、15、20 μg/mL的C-ASX-NP和C-ASX-AG-NP分散液加入至4 mL ABTS溶液中，使样品的最终质量浓度达到0.5～1.0 μg/mL，充分混合后静置7 min，在734 nm处读取其吸光度，记为As，以10 mmol/L的PBS做空白，记为Ac，计算公式为：

1.2.7.2 DPPH·清除能力测定

参考Meng等[19]的方法并稍作修改，具体方法为：将2 mL新鲜制备的0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液加入2 mL同浓度的虾青素丙酮溶液、荷载虾青素的薏米醇溶蛋白纳米颗粒、荷载虾青素的阿拉伯胶-薏米醇溶蛋白纳米颗粒中，虾青素质量浓度分别为20、15、10、5 μg/mL，避光反应30 min后在518 nm处测定其吸光值，记为A1，将2 mL无水乙醇代替DPPH乙醇溶液进行相同处理，记为A2，将2 mL无水乙醇加入2 mL DPPH乙醇溶液进行相同处理，其吸光度记为A0，样品的DPPH自由基清除率公式为：

1.3 数据处理

所有实验均进行3次，结果以平均值±标准偏差表示。以Excel 2017进行数据的分析整理，以SPSS 22.0对数据进行单因素方差分析和Duncan检验，P<0.05表示差异显著，用Origin 2017作图。

2 结果与分析

2.1 阿拉伯胶对薏米醇溶蛋白-虾青素纳米颗粒的粒径、PDI和ζ-电位的影响

不同醇溶蛋白与阿拉伯胶比例制备的薏米醇溶蛋白-虾青素-阿拉伯胶纳米颗粒(C-ASX-AG-NP)平均粒径、PDI及ζ-电位如图1所示。薏米醇溶蛋白-虾青素纳米颗粒(C-ASX-NP)的平均粒径为120.9 nm，制备出了比小麦醇溶蛋白-阿拉伯胶-白藜芦醇纳米颗粒更小粒径的纳米颗粒[14]。C-ASX-AG-NP的平均粒径随着薏米醇溶蛋白与阿拉伯胶的比例(C∶AG)的减小而呈先减小再增大的趋势。当C∶AG为2∶1时，C-ASX-AG-NP平均粒径最小，但高于C-ASX-NP的。C-ASX-NP的ζ-电位为39 mV，而阿拉伯胶在此pH下带负电荷，阿拉伯胶可以通过静电相互作用吸附在C-ASX-NP表面，形成蛋白质-多糖的核-壳结构[12，20]，导致纳米颗粒的平均粒径显著增大，颗粒表面净电荷由正电荷转变为负电荷。这和阿拉伯胶对麦醇溶蛋白蛋白纳米颗粒的影响一致[14]。当C∶AG为1∶1时，PDI达到最小值，此时颗粒大小最为均匀。C-ASX-NP当C∶AG为3∶1～1∶1.5时，C-ASX-AG-NP的ζ-电位无显著性差异(P>0.05)。当C∶AG增加到1∶2时，C-ASX-AG-NP的ζ-电位为-17.6 mV，此时颗粒的所带净电荷最少。

2.2 阿拉伯胶对薏米醇溶蛋白-虾青素纳米颗粒的包埋率和荷载量的影响

C∶AG对虾青素包埋率和荷载率的影响如表1所示。在未加入阿拉伯胶时C-ASX-NP的包埋率和荷载量分别为49.18%和2.45 mg/g，随着C∶AG的增大，荷载率显著增大，包埋率则先增大后减小。综合图1和表1，发现当C∶AG为1∶1时有较高的包埋率且颗粒粒径较小(163.43 nm)，具有较小的分散系数(0.123)，因此选择其进行后续的研究。

表1 阿拉伯胶对薏米醇溶蛋白-虾青素纳米颗粒荷载率包埋率的影响

2.3 阿拉伯胶对薏米醇溶蛋白-虾青素纳米颗粒稳定性的影响

2.3.1 pH稳定性

C-ASX-NP和C-ASX-AG-NP在不同pH环境中的稳定性如图2所示。C-ASX-NP在pH 2.0～5.0时，其平均粒径没有显著性变化，具有良好的稳定性。而在pH 6.0和pH 7.0时C-ASX-NP的ζ-电位分别为-2.6 mV和-7.0 mV，此时平均粒径增大至4 000 nm以上。这可能是由于表面所带净电荷减少，分子间的静电斥力减少引起的。pH 5.0和pH 6.0时，C-ASX-NP的ζ-电位分别为33.2 mV和-2.62 mV，在pH5.8附近达到了等电点。C-ASX-AG-NP在pH 2.0时会产生沉淀，所带净电荷少，这可能是由于pH接近阿拉伯胶的等电点(pK-2.2)[21]，产生了静电屏蔽，导致纳米颗粒聚集[22]。C-ASX-AG-NP在pH 3.0～6.0时，其平均粒径无显著变化，但其ζ-电位增加。当pH增加至 7.0时粒径升高至949.9 nm，低于相同pH下的C-ASX-NP的平均粒径。由此可知，阿拉伯胶可以增强薏米醇溶蛋白-虾青素纳米颗粒在pH 6.0～7.0时的稳定性。

2.3.2 盐离子稳定性

阿拉伯胶对C-ASX-NP盐离子稳定性的影响如图3所示。C-ASX-NP和C-ASX-AG-NP的平均粒径随着氯化钠浓度的增加而增加。C-ASX-NP在未加入氯化钠时粒径仅为121.73 nm，当氯化钠浓度增大至25 mmoL/L时，纳米颗粒的粒径达到5 362.33 nm，C-ASX-NP发生了聚集，并出现明显沉淀。当氯化钠浓度为12.5～37.5 mmoL/L时，C-ASX-AG-NP平均粒径增加，但增加幅度明显小于C-ASX-NP，说明阿拉伯胶可以在一定程度上增强薏米醇溶蛋白的虾青素纳米颗粒的盐离子耐受性。当氯化钠浓度达到50 mmoL/L时，C-ASX-AG-NP粒径达到3 305.33 nm，并出现明显的沉淀，胶体颗粒出现失稳现象。这些可以归因于盐对纳米粒子之间静电相互作用的影响[23]。2种纳米颗粒所带净电荷随着NaCl的增加而减小，这是由于离子结合和静电屏蔽的作用。因此，在高浓度盐的存在下，纳米颗粒的净电荷减少，导致它们之间的静电斥力降低，从而促进了它们的聚集[24]。

2.3.3 储藏稳定性

将制备的C-ASX-NP和C-ASX-AG-NP颗粒分别置于25 ℃和4 ℃条件下储藏，其粒径和ζ-电位的变化如图4所示。C-ASX-NP和C-ASX-AG-NP初始平均粒径分别为113.73、144.83 nm，在25 ℃条件下储藏，C-ASX-NP储藏至5 d时粒径减小至106.13 nm，储藏至10 d时出现沉淀并散发出臭鸡蛋气味，此时C-ASX-NP已变质，并且此时ζ-电位接近0。随着储藏时间的增加，C-ASX-AG-NP平均粒径增大，储藏至15 d时粒径增大至281.97 nm，但此时仍未出现沉淀及变质。在4 ℃条件下储藏时，C-ASX-NP的平均粒径随着时间的增加而减小，而ζ-电位在0～10 d时无明显变化，储藏至15 d时ζ-电位下降。C-ASX-AG-NP平均粒径随着时间的增加而增大，储藏到15 d时，C-ASX-NP和C-ASX-AG-NP平均粒径分别为107.23 nm和156.2 nm，C-ASX-AG-NP随着储藏时间的增加所带负电荷逐渐减少，这可能是由于少量阿拉伯胶从纳米颗粒上脱落导致的。

C-ASX-NP和C-ASX-AG-NP虾青素保留率随储藏时间的变化如图5所示。由于相同条件下的游离虾青素在30 min内虾青素保留率降至8.3%。25 ℃下储藏5～10 d时，C-ASX-AG-NP的虾青素保留率高于C-ASX-NP，说明阿拉伯胶的加入能够减缓虾青素的降解。当储藏至15 d时，C-ASX-NP已经完全沉淀，此时数据不做参考。在4 ℃储藏时，2种纳米颗粒的虾青素保留率均高于25 ℃储藏，说明低温能够缓解虾青素的降解。

图5 薏米醇溶蛋白-虾青素阿拉伯胶复合纳米颗粒在不同温度下储藏时虾青素的保留率

2.4 阿拉伯胶对薏米醇溶蛋白-虾青素纳米颗粒结构的影响

2.4.1 X衍射图谱分析

如图6所示，薏米醇溶蛋白分别在9.5°和19.6°有宽衍射峰，这和麦醇溶蛋白[14]一样呈现出2个峰。阿拉伯胶在19.5°处有存在1个宽衍射峰，说明薏米醇溶蛋白与阿拉伯胶是具有无定形结构特征的非晶体。虾青素有多个尖锐的衍射峰，这是因为虾青素的晶化程度高，而被包埋的虾青素颗粒均未出现尖锐的衍射峰，说明虾青素以无定形态被成功包埋在纳米颗粒中，在其他的类胡萝卜素中也有出现类似现象，如叶黄素在纳米体系中封装后由于纳米颗粒限制了叶黄素的结晶变成了非晶体[25]。加入阿拉伯胶的纳米颗粒的峰值强度低于未加入阿拉伯胶的纳米颗粒的峰值强度，这说明薏米醇溶蛋白与阿拉伯胶之间存在非共价相互作用。

图6 X射线衍射图谱

2.4.2 透射电镜

C-ASX-NP和C-ASX-AG-NP的透射电镜如图7所示。荷载虾青素的薏米醇溶蛋白纳米颗粒为表面光滑的球体，粒径在100～150 nm之间，并且在加入阿拉伯胶后的纳米颗粒粒径增加，这与粒径测定结果一致。

图7 透射电镜图

2.5 抗氧化能力

2.5.1 阿拉伯胶对薏米醇溶蛋白-虾青素纳米颗粒ABTS+·清除能力的影响

如图8所示，在相同的虾青素浓度下， C-ASX-AG-NP的ABTS+·清除率高于C-ASX-NP，这可能是因为加入了阿拉伯胶后可以增强纳米颗粒的复溶性[14]。虾青素的抗氧化能力虽然极强，但它作为亲脂化合物，如果将其置于水环境中，其抗氧化活性会大大降低，在食品系统中，虾青素与自由基的接触多少是限制其生物活性的主要因素[26]。游离的虾青素在水相中分散性较差，与ABTS+·接触有限，所以ABTS+·清除率较低。在相同浓度下，游离的虾青素(ASX)的ABTS+·清除率低于C-ASX-AG-NP和C-ASX-NP，因此采用薏米醇溶蛋白和阿拉伯胶荷载虾青素可以显著提高其抗氧化性。

图8 不同虾青素浓度的ABTS+·清除能力

2.5.2 阿拉伯胶对薏米醇溶蛋白-虾青素纳米颗粒DPPH·清除能力

C-ASX-NP、C-ASX-AG-NP及游离虾青素对DPPH·清除能力如图9所示。当虾青素质量浓度为20 μg /mL时，C-ASX-NP、C-ASX-AG-NP、游离虾青素的DPPH·清除率分别为73.55%、81.53%、11.08%。加入了阿拉伯胶的C-ASX-AG-NP自由基清除率大于未加入阿拉伯胶的C-ASX-NP的自由基清除率，未加入阿拉伯胶的C-ASX-NP的自由基清除率大于游离虾青素的自由基清除率，这与ABTS+·清除能力实验测定结果一致。所不同的是，游离的虾青素对DPPH·清除率远低于C-ASX-NP和C-ASX-AG-NP，这是因为包埋改善了虾青素的分散性，DPPH试剂容易渗透到颗粒的核心，增加了自由基接触的表面积，从而促进了DPPH·清除率的提高[27,28]。

图9 不同虾青素浓度的DPPH·清除率

3 讨论

结合颗粒大小、电位、XRD、SEM形貌等性质，发现阿拉伯胶是以非共价结合的方式和薏米醇溶蛋白-虾青素纳米颗粒结合。吴炜豪[14]研究指出，阿拉伯胶通过改变纳米颗粒的结构增强了其制备的麦醇溶蛋白纳米颗粒的pH稳定性及其对于白藜芦醇的保留率稳定性，然而本研究发现阿拉伯胶虽能显著增加纳米颗粒的盐离子稳定性和储藏稳定性，但在不同的pH环境下，其仅能增强在等电点附近的pH稳定性，而在较低pH时不稳定，还有待进一步研究。

4 结论

当薏米醇溶蛋白与阿拉伯胶比例为1∶1时纳米颗粒有较高的包埋率和较小的粒径。阿拉伯胶的加入使C-ASX-AG-NP在pH3.0～6.0的环境中均能稳定存在，并且能够提高纳米颗粒的盐离子耐受性。C-ASX-AG-NP在室温中的稳定性要高于C-ASX-NP，并且对于虾青素的保留率略高于C-ASX-NP。虾青素以无定形态被包埋在薏米醇溶蛋白纳米颗粒的内核中，而阿拉伯胶通过非共价结合的方式复合在纳米颗粒表面。在抗氧化能力实验中，受虾青素溶解度的影响，2种纳米颗粒的自由基清除率均远大于游离的虾青素。因此本研究制备的C-ASX-AG-NP具有较好的稳定性，并且相较于未包埋的虾青素具有较高的抗氧化活性。