社区老年高血压合并2型糖尿病病人衰弱程度与肠道微生物的关系

张炳山 郁洁 杨颖 王卓 陆守荣 陈蓉 陆文伟 郁志明 洪侃

随着人口老龄化进程加快，与年龄有关的疾病给医疗保健造成巨大负担。衰弱(frailty)是一种由多因素引起的老年综合征，表现为生理储备减少和功能损害增加，导致应激能力降低[1]，其对住院、失能和死亡等不良结局的预测价值优于实际年龄[2]。衰弱在老年高血压和T2DM病人中非常常见。中国老年高血压及2型糖尿病管理指南均建议评估老年病人是否存在衰弱[3-4]。肠道微生物(intestinal microbiome)被称为人类“第二基因组”，具有适应性和可塑性的特征，在维持宿主健康和与年龄相关的疾病中发挥重要作用[5]。肠道微生物受宿主和环境因素之间复杂的相互作用的调控，如年龄、饮食、药物、遗传学和生活方式等。肠道微生物的变化可以改变宿主的生理机能，增加许多疾病的发病率和(或)严重性[6]，如炎症性肠病、T2DM、肥胖、心血管疾病和神经退行性疾病。在宿主衰老的过程中，肠道微生物的组成和功能发生了巨大变化，老年人的肠道微生物组成与成年人不同[7]。肠道微生物失调可导致肠道屏障功能障碍、运动障碍以及肠道炎症[8]，导致与衰弱有关的全身低度炎症[9]。我们对社区高血压合并T2DM的老年病人进行了一项横断面调查研究，探讨老年高血压合并T2DM病人的衰弱程度与肠道微生物变化的关系，以期为老年高血压合并T2DM病人全面管理及干预提供理论依据。

1 研究方法

1.1 研究对象 2018年5～10月，对居住在无锡市新安社区的老年居民进行横断面调查。纳入标准：在社区生活至少5年，年龄≥65岁；血压≥140/90 mmHg或既往诊断为高血压，目前服用降压药者；通过口服糖耐量试验诊断为T2DM或既往诊断为T2DM目前用药者。排除标准：各种器质性疾病终末期；诊断明确的胃肠道疾病，如炎症性肠病、肠梗阻、胃肠道肿瘤等疾病以及半年内有腹部手术史；有严重的视力、听力和语言障碍，不能完成老年综合评估者；在过去30 d内接受过影响肠道菌群的药物治疗，如抗生素或抗精神病药物治疗；过去3个月内补充益生菌制剂。研究经无锡市人民医院医学伦理委员会批准，参与者均签署书面知情同意书。

1.2 人口学特征和临床评价 通过面对面访谈收集病人信息资料，对合并症及其用药情况进行评估。

1.3 老年综合评估 采用Fried衰弱表型[10]诊断衰弱，满足5项标准中的1～2项被定义为衰弱前期，满足3项标准即可诊断为衰弱。本研究根据Fried衰弱表型结果将病人分为对照组、衰弱前期组和衰弱组。所有病人均接受认知功能(MoCA量表)、日常行为能力[日常生活能力量表(ADL)]、精神状态[老年抑郁症量表(GDS-15)]、营养状况[迷你营养评估简表(MNA-SF)]、跌倒风险(Morse跌倒量表)、药物依从性[Morisky用药依从性问卷(MMAS-8)]、社会支持度[社会支持评定量表(SSRS)]及疼痛程度(VAS量表)评估。

1.4 生化指标检测 所有参与者禁食8 h，于次日清晨采血。血样室温下凝固30 min，3000 r/min 4 ℃下离心15 min。使用自动生化分析仪检测FPG、HbA1c、LDL-C等。

1.5 肠道微生物基因组检测 参与者在研究者的指导下用专用干燥无菌粪便收集器收集新鲜粪便样本(约10 g)，2 h内送到实验室，并保存在-80 ℃环境中。使用Fast DNA Spin试剂盒(MP Biomedicals，Santa Ana，CA，USA)从粪便样本中提取微生物基因组DNA。使用通用引物(341F和805R)扩增16S rRNA基因V3～V4区域。PCR产物用GENECLEAN Turbo试剂盒(MP Biomedical，北京，中国)进行纯化，用Quant-iT PicoGreen dsDNA检测试剂盒(Life Technologies，加州)进行定量。文库使用TruSeq DNA LT样品制备试剂盒(Illumina, Santiago, CA，USA)制备，并在Illumina MiSeq PE300平台上使用MiSeq试剂盒(Illumina, Santiago, CA， USA)进行测序。

2 结果

2.1 3组病人的临床特征 共181例老年病人(年龄65～80岁，女性占60.2%)纳入本研究，衰弱者23例(12.7%)，衰弱前期者46例(25.4%)。衰弱组与对照组年龄、糖尿病病程、合并疾病数量、用药数量、ADL评分、MNA-SF评分、MoCA评分、SSRS评分、血清白蛋白(ALB)水平差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.2 3组病人肠道微生物多样性变化 通过α和β多样性检测评估3组病人肠道微生物菌群的差异。利用Chao1和Shannon指数从2个维度对种群内的细菌丰度和群落稳定性进行评估，发现3组的Chao1和Shannon指数差异均有统计学意义(Chao1：F=7.941，P<0.001；Shannon指数：F=10.489，P<0.001)，但变化趋势不一致，不能说明α多样性存在明显的差异，见图1。主坐标分析(PCoA)显示3组病人肠道菌群有差异，其中β多样性的非加权和加权PCoA在衰弱组中的肠道微生物分类高于对照组及衰弱前期组(P<0.05)，见图2。

注：与对照组比较，*P<0.05；与衰弱前期组比较，#P<0.05

2.3 不同健康状态病人肠道菌群的组成 在门水平上，前5种细菌为Fimicute、Bacteroidetes、Proteobacteria、Actinobacteria、Fusobacteria。与对照组相比，衰弱组Actinobacteria相对丰度增加，Fusobacteria相对丰度减少，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图3。

注：与对照组比较，*P<0.05；与衰弱前期组比较，#P<0.05

在属水平上，与对照组相比，衰弱组的Bifidobacterium和Lactobacillus丰度增加(P=0.043和P=0.015)，Adlercreutzia、Clostridium、Coprococcus、Faecalibacterium、Phascolarctobacterium、Roseburia、Turicibacter7个种属细菌丰度减少(P<0.05)。衰弱前期组Eggerthella较对照组丰度增加(P=0.031)。与衰弱前期组相比，衰弱组Lactobacillus丰度增加(P=0.031)，Clostridium、Coprococcus和Eggerthella丰度减少(P=0.002、P=0.045和P=0.026)。衰弱组其他未归类细菌较衰弱前期组和对照组明显减少(P<0.05)，见图4。

注：与对照组比较，*P<0.05；与衰弱前期组比较，#P<0.05

3 讨论

本研究使用Fried衰弱表型对181例社区老年高血压合并T2DM病人调查发现，衰弱和衰弱前期的患病率分别为12.7%和25.4%，提示衰弱在社区老年高血压合并T2DM病人中发病率较高，且高龄、多病共存、多重用药、糖尿病病程长、抑郁情绪、营养不良、认知功能下降、社会支持差、跌倒风险增加可能是衰弱的相关危险因素，与既往的研究结果相似[11]。

肠道微生物组成的变化与衰老过程及其相关疾病密切相关[12]。本研究结果显示，与对照组相比，衰弱组肠道微生物α多样性变化不明显，但β多样性增加。Zhang等[13]在老年住院病人中发现衰弱组肠道微生物α多样性与对照组相似，而β多样性大于对照组，与本研究结果一致。Margiotta等[14]在慢性肾功能不全的病人中也得出了相同的结论。但Jackson等[15]对728名女性双胞胎的粪便样本分析发现，衰弱与肠道微生物群α多样性之间呈负相关。虽然目前无法确定衰弱是微生物群多样性改变的原因还是结果，但是观察到的微生物变化可能至少部分与健康损害相关。通过改变已知影响肠道微生物多样性的生活方式如饮食来维持或改善肠道微生物多样性，有可能是促进健康老龄化的有效措施。

在门水平上，本组病人排名前5位的肠道细菌依次为Fimicutes、Bacteroidetes、Proteobacteria、Actinobacteria、Fusobacteria；相比于对照组，衰弱组的Actinobacteria相对丰度增加，Fusobacteria相对丰度减少。Actinobacteria和Fusobacteria是组成人类肠道微生物系统的两个重要菌群，各自包含多种不同的种属。Claesson等[16]将161名≥65岁老年人的粪便微生物与9名年轻者进行了对比，发现与疾病或健康状态有关的Actinobacteria和Fusobacteria的比例在个体之间差异很大。另一研究显示，衰弱老人粪便微生物中属于Fusobacteria菌门的F.prausnitzii的丰度显著降低[17]，该细菌是一种重要的产生具有抗炎特性的丁酸盐的细菌。Jackson等[15]在衰弱前期的个体中也发现F.prausnitzii丰度减少，而属于Actinobacteria菌门的与炎症有关的Eggerthelladifficile丰度增加[18]。

在属水平上，本研究发现，相比于对照组，衰弱组病人的Bifidobacterium和Lactobacillus的相对丰度有所增加。Bifidobacterium目前被认为是较为常见的有益菌。Wu等[19]发现，相较于年轻人(21～33岁)及低龄老年人(68～88岁)，Bifidobacterium在撒丁岛百岁老人的肠道微生物群中的丰度是增加的；Biagi等[20]也发现，意大利百岁老人(99～109岁)的肠道菌群Bifidobacterium的丰度高于65～75岁及22～48岁人群。但是，这些研究并没有对这些长寿老人的健康状态进行评估，因此，肠道菌群富含Bifidobacterium的长寿老人是否存在衰弱不得而知，Bifidobacterium在维持老年健康和长寿中的作用还有待进一步的研究和探索。Lactobacillus是肠道中另一常见的菌属，约有170种，其中部分菌株能够参与刺激免疫功能，帮助食物和矿物质的消化和(或)吸收，并抑制外源性或有害细菌的生长[21]。van Tongeren等[17]发现,衰弱评分越高,志愿者的肠道菌群Lactobacillus数量越少，本研究结果与其正好相反，即衰弱组的Lactobacillus相对丰度显著高于衰弱前期组。这是因为Lactobacillus并不是一直都扮演着促进健康的角色，也有研究发现，在精神分裂症病人中，Lactobacillus的丰度显著高于正常者，并且与症状的严重程度呈正相关[22]。Margiotta等[14]发现,在慢性肾脏病病人中，Lactobacillus的丰度较非慢性肾脏病病人增加。这可能与不同的Lactobacillus菌种在健康中所起的作用不同有关。Wang等[23]研究发现，相较于健康者，终末期肾脏病病人只有Lactobacillusplantarum和Lactobacillusparacasei的丰度降低。因此，进一步鉴别出有益于健康和有害于健康的菌种及其变化趋势更有利于指导临床。

本研究结果显示，相比于对照组，衰弱组病人的Adlercreutzia、Clostridium、Coprococcus、Faecalibacterium、Phascolarctobacterium、Roseburia、Turicibacter相对丰度存在不同程度的下降。Clostridium和Coprococcus也被认为是肠道的有益菌群，具有产生丁酸盐、发挥抗炎的作用。在本研究中，衰弱组Clostridium和Coprococcus的丰度比对照组和衰弱前期组低。Haran等[24]也发现，随着躯体衰弱程度增加，Clostridium属，特别是其中的ClostridiumclusterXIVa丰度逐渐降低。目前已经证实，Coprococcus的相对丰度与反应性疾病、抑郁症和肠易激综合征呈负相关。Lim等[25]对176名韩国老年人的肠道微生物分析发现，衰弱老人的Coprococcuseutactus丰度显著低于非衰弱者。此外，该研究还发现不同的Clostridium和Coprococcus菌种可能在衰弱发生中的作用不同，未来的研究应该精确到菌种和菌株。Faecalibacterium是产生具有抗炎作用的丁酸盐的另一菌属[26]，本研究发现该菌属在衰弱组肠道微生物中的含量显著减少，与van Tongeren等[17]的研究结果一致。目前还未见他人研究Roseburia、Turicibacter、Adlercreutzia、Phascolarctobacterium在衰弱人群中的变化特征。研究显示，Roseburia是一种厌氧菌，属于ClostridiumclusterXIVa[27]，已被证明在维持肠道屏障功能和免疫防御方面发挥重要作用。Xu等[28]研究发现，Roseburia的丰度与慢性炎症因子IL-6呈负相关，可能与衰弱的发生有关。Turicibacter是一种与脂质代谢紊乱相关的菌属，具有抗肥胖作用[29]。Turicibacter的丰度降低可能导致老年代谢相关性疾病如肥胖，并促进衰弱的发生。Adlercreutzia是一个与精神疾病相关的菌属，在精神分裂症病人中，该菌属的丰度较低[22]。该菌属还与老年人的活跃程度有关，在活跃程度较高的老年人中，Adlercreutzia的相对丰度较低[30]。一项衰弱干预研究发现，衰弱老人补充益生元可增加Phascolarctobacterium的丰度，降低趋化因子CXCL11水平，改善老年人的衰弱状态[31]，间接说明了Phascolarctobacterium与衰弱呈负相关，本研究结果也印证了此论点。

Eggerthella被认为是衰弱的一个肠道微生物标志物。Margiotta等[14]研究发现，相较于非衰弱者，慢性肾脏病衰弱病人的Eggerthellaspp含量更为丰富。Ponziani等[32]研究发现，与非肌少症者相比，合并肌少症的肝硬化病人的Eggerthella丰度更高。Jackson等[15]也发现衰弱前期个体的Eggerthelladifficile丰度较非衰弱者增加。而本研究发现，相较于非衰弱组，Eggerthella的相对丰度在衰弱前期组中较高，但在衰弱组中却是下降的，这一变化在既往的研究中尚未见报道。这一现象是否与衰弱病人的多重用药有关，尚需进一步研究。

总之，衰弱在老年高血压合并T2DM病人中非常常见。年龄、糖尿病病程、多病共存、多重用药、营养不良、认知功能下降、生活能力下降、跌倒风险增加与衰弱相关。衰弱病人的肠道微生物组成不同于非衰弱者，存在多个菌属的变化，提示肠道微生物在衰弱的发生发展过程中的作用和机制复杂，有望成为衰弱干预的新途径，但需要进一步的研究。