NaCl和CaCl2对箭筈豌豆芽苗菜酚类物质积累与抗氧化性的影响

赵齐燕 唐 宁 赵德宸 张博雅 程永强

(中国农业大学食品科学与营养工程学院植物源功能食品北京市重点实验室，北京 100083)

箭筈豌豆(ViciasativaL.)是蔷薇目豆科野豌豆属一年生草本植物，是优良的绿肥[1]、饲料[2]和重要的粮食作物，但菜用开发程度较低。与其他野豌豆属植物相比，箭筈豌豆含有较丰富的酚类物质和较强的抗氧化性[3]，多酚含量是白豆的1.5倍，扁豆的1.3倍[4]，多酚、黄酮还原力和清除活性均高于大豆多酚[5]，酚酸是箭筈豌豆种子的优势成分[6]。

NaCl胁迫是一种非生物胁迫，会增加活性氧(ROS)含量，诱导酚酸积累和抗氧化能力的提升[7]。NaCl处理可缩短鳞茎草根茎长，并促进总酚、总黄酮、总花青素、总游离氨基酸和总可溶性糖含量的积累[8]；NaCl处理下，红花中儿茶素、苯甲酸和山奈酚含量增加[9]；大麦芽苗在Na+作用下PAL、C4H和4CL的基因和酶活上升，酚酸和黄酮类化合物含量分别提高了11.19%和32.54%[10]。

CaCl2也具有调节酚酸含量的能力。在豆芽生长过程中，CaCl2可以通过初级代谢和次级代谢、离子运输、信号转导和转录调控[11]调节酚类、维生素以及其他营养物质含量；Ca2+还能够延长豆芽茎长，提高其产量[12]。研究[13]表明，Ca2+在麦芽中通过调控基因、蛋白表达以及PAL、C4H和4CL等酶活性，促进酚的合成。

发芽是一种快速、清洁、经济的食品开发方式，在豌豆苗[14]、花生芽[15]、藜麦[16]等物质的萌发过程中，酚类物质和抗氧化能力都得到了迅速提升。已有研究[4]显示，箭筈豌豆黑暗条件发芽5 d，其总酚含量比萌发前提高了18.7 mg/kg，是白豆芽菜和扁豆芽菜的1.40和1.36倍。但NaCl和CaCl2对箭筈豌豆芽苗菜酚酸含量和抗氧化系统的影响和作用机制暂不明确。因此研究拟采用NaCl和CaCl2水培箭筈豌豆芽苗菜，以豌豆苗、黄豆芽、绿豆芽为对照，分析芽苗菜酚酸含量、抗氧化能力变化，并通过测定抗氧化酶关键酶活力、酚酸合成关键酶活力和基因表达探究两种盐溶液对其抗氧化水平影响的作用机理，以期为今后箭筈豌豆芽苗菜开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

箭筈豌豆种子、豌豆苗：市售；

绿豆芽：北京方圆平安生物科技股份有限公司；

黄豆芽：北京中禾清雅芽菜生产有限公司；

APX、CAT、SOD、GR、POD、GST试剂盒：北京索莱宝科技有限公司；

原儿茶酸、香草酸、绿原酸、对香豆酸、没食子酸、槲皮素、阿魏酸、芦丁、儿茶素、芥子酸、肉桂酸、表儿茶素：HPLC≥98%，北京索莱宝科技有限公司；

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：HPLC≥97%，东京化成工业株式会社；

芹菜素、山奈酚、丁香酸、水杨酸：HPLC≥98%，上海安普实验科技股份有限公司；

对羟基苯甲酸、木犀草素：HPLC≥98%，上海甄准生物科技有限公司；

其他试验试剂均为国产分析纯。

1.1.2 主要仪器设备

酶标仪：SMP500-15275-SWXN型，美谷分子仪器有限公司；

智能培养箱：PRx-450C型，宁波赛福实验仪器有限公司；

色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3型(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)，美国沃特世公司；

超高效液相色谱串联质谱仪：ACQUITY UPLC TQD型，美国沃特世公司；

离心机：5810R/5415D型，德国艾本德公司；

qPCR仪：7500型，赛默飞科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 箭筈豌豆芽苗菜开发 参照Swieca等[17]的方法并稍作修改。在体积分数0.1%次氯酸钠溶液中浸种30 min，蒸馏水洗至中性，去离子水中浸泡12 h。并分别在去离子水、15 mmol/L NaCl、0.5 mmol/L CaCl2、15 mmol/L NaCl+0.5 mmol/L CaCl2溶液中育苗。温度25 ℃，湿度80%，黑暗条件下培养4 d，光照强度20%，光照周期12 h/12 h条件下培养1 d。采集芽苗菜可食用部分，立即用液氮冷冻，-80 ℃冻存后冻干，0.42 mm粉碎过筛，-20 ℃保存备用。

1.2.2 鲜重、茎长、种子活力测定 以100支去根芽苗菜为一组，用分析天平测定鲜重，游标卡尺测量茎长，并按式(1)计算种子活力指数。

VI=∑(Gt/Dt)×L，

(1)

式中：

VI——种子活力指数；

L——茎长，cm；

Dt——种子发芽天数，d；

Gt——第t天发芽种子数，个。

1.2.3 酚类物质提取与总酚、总黄酮含量测定

(1) 游离态和结合态酚类物质提取：参照马燕[18]的方法。

(2) 总酚、总黄酮含量测定：分别采用福林酚法[10]和黄酮沉淀法[19]。

1.2.4 酚酸含量测定 参照黄彪等[20]的方法并稍作修改。流动相A为乙腈，流动相B为0.05%甲酸水溶液，流速0.3 mL/min，柱温30 ℃；进样量5 μL，自动进样器温度20 ℃，梯度洗脱程序见表1。负离子模式下，毛细管电压2.90 kV，离子源温度120 ℃，脱溶剂气温度400 ℃，锥孔气(N2)流速50 L/h，脱溶剂气(N2)流速600 L/h，碰撞气(Ar)流速0.07 mL/min。正离子模式下，毛细管电压3.10 kV，其余条件与负离子模式相同。

表1 UPLC洗脱程序Table 1 Elution program of UPLC

1.2.5 PAL、C4H、4CL酶活性测定

(1) PAL活性：参照Zhang等[21]的方法。

(2) C4H活性：参照Chance等[22]的方法。

(3) 4CL活性：参照陈雷等[23]的方法。

1.2.6 酚酸合成关键酶基因表达量测定 采用TRIzol LS Reagent试剂盒提取箭筈豌豆芽苗菜总RNA，经琼脂凝胶电泳验证，以总RNA为模板，用Thermo公司反转录试剂盒合成cDNA。选取Tua基因为内参基因，依据NCBI数据库Primer designing tool设计引物(见表2)，目标基因相对表达量用2-ΔΔCT比较阈值法表示。

表2 RT-qPCR正向引物和反向引物Table 2 Forward and reverse primers of RT-qPCR

1.2.7 APX、CAT、SOD、GR、POD、GST酶活力测定 取新鲜芽苗菜制作组织匀浆，按试剂盒说明书测定APX、CAT、SOD、GR、POD、GST酶活力。

1.2.8 体外抗氧化评价

(1) DPPH自由基清除率：参照Koodkaew[24]的方法。

(2) ABTS自由基清除率：参照Islam等[25]的方法。

1.2.9 数据处理 运用Excel、SPSS 25.0和Origin 2022软件处理数据，每个处理重复3次。

2 结果与分析

2.1 对箭筈豌豆芽苗菜鲜重、茎长、种子活力的影响

由图1可知，15 mmol/L NaCl处理下，鲜重降低了20.11%，茎长缩短了27.88%，种子活力指数降低了29.57%，即Na+给芽苗菜的鲜重、茎长、种子活力造成了不同程度的负面影响；0.5 mmol/L CaCl2处理下，鲜重增长了31.70%，茎长增长了26.05%，种子活力指数增长了23.72%，即Ca2+显著促进了箭筈豌豆芽苗菜的生长。两种盐溶液共施时，鲜重恢复了13.94%，茎长和种子活力恢复至与对照组无显著差异，即Ca2+缓和了Na+的胁迫作用。

字母不同表示差异显著(P<0.05)图1 鲜重、茎长、种子活力指数Figure 1 Fresh weight, stem length and vigor index of seeds

2.2 对箭筈豌豆芽苗菜总酚、总黄酮含量的影响

由图2可知，箭筈豌豆芽苗菜酚类物质主要以游离态存在。NaCl处理下，游离态酚含量提升了29.36%，游离态黄酮含量提升了33.41%；CaCl2处理下，游离态酚含量上升了26.45%，游离态黄酮含量上升了28.04%；两者同施时，总酚含量由(10.63±0.40) mg GAE/g DW提升至(15.76±0.36) mg GAE/g DW，总黄酮含量由(9.36±0.06) mg GAE/g DW上升至(14.32±0.08) mg GAE/g DW。结果表明，NaCl和CaCl2能够协同促进酚类物质富集。

字母不同表示差异显著(P<0.05)图2 总酚和总黄酮含量Figure 2 The content of total phenolics and flavonoids

2.3 箭筈豌豆芽苗菜酚酸含量变化

由表3可知，对照组中，共检出16种酚酸，总量为(51.00±3.06) mg/kg DW，其中，游离态酚酸总量为(21.87±0.81) mg/kg DW，结合态酚酸总量为(29.16±2.22) mg/kg DW，主要为芦丁、阿魏酸和槲皮素，含量分别为(22.50±0.49)，(8.18±0.68)，(6.70±0.02) mg/kg DW。

表3 箭筈豌豆芽苗菜游离态和结合态酚酸含量†Table 3 The content of free and combined phenolic acid of CV sprouts mg/kg DW

箭筈豌豆芽苗菜中，儿茶素、绿原酸、肉桂酸只以游离态存在，对羟基苯甲酸、原儿茶酸只以结合态存在，其余酚酸以游离、结合两态存在。在NaCl处理下，8种酚酸含量显著升高，其中阿魏酸含量上升了54.77%，芥子酸含量上升了107.03%；在CaCl2处理下，芦丁含量上升了122.44%，对香豆酸含量上升了75.97%，槲皮素、芥子酸、阿魏酸等11种酚酸含量也有所提升。

NaCl和CaCl2同施组，芦丁含量比对照组、NaCl处理组和CaCl2处理组分别提升了150.02%，151.56%，114.65%，阿魏酸含量提升至(13.09±0.52) mg/kg DW，木犀草素含量提升了34.75%，原儿茶酸含量提升了228.57%。综上，Na+和Ca2+同施对芦丁、阿魏酸、木犀草素和原儿茶酸的合成具有协同促进作用。

对香豆酸、槲皮素含量在NaCl处理下分别下降了11.19%，22.32%，在NaCl和CaCl2共同作用下，二者分别比对照组提高了21.34%，6.80%，山奈酚在NaCl作用下下降了21.37%，经NaCl和CaCl2共同作用恢复至与对照组无明显差异。试验表明，Ca2+解除了Na+对对香豆酸、槲皮素、山奈酚合成的胁迫作用。

由表4可知，豌豆苗中优势成分是对香豆酸、阿魏酸、芥子酸、山奈酚和槲皮素，黄豆芽优势成分是对香豆酸、阿魏酸、芥子酸、丁香酸，绿豆芽中含量最为突出的是对香豆酸。豌豆苗、黄豆芽和绿豆芽中的对香豆酸含量远高于箭筈豌豆芽苗菜。

表4 豌豆苗酚酸含量†Table 4 The content of phenolic acids in pea sprouts mg/kg DW

蒸馏水培养下，箭筈豌豆芽苗菜中共检出16种酚酸，豌豆苗、黄豆芽、绿豆芽中分别只检出12，8，9种酚酸，说明箭筈豌豆芽苗菜的酚酸种类更为丰富。箭筈豌豆芽苗菜中芦丁和对羟基苯甲酸含量显著高于豌豆苗、黄豆芽和绿豆芽。箭筈豌豆芽苗菜芦丁含量为(22.50±0.49) mg/kg DW，分别为豌豆苗、黄豆芽及绿豆芽的31.25，102.27，2.31倍。对羟基苯甲酸含量为(1.18±0.53) mg/kg DW，是豌豆苗的1.51倍，而黄豆芽和绿豆芽中未检出对羟基苯甲酸。

NaCl—CaCl2体系富集了箭筈豌豆芽苗菜的优势酚酸组分。在NaCl和CaCl2培养下，箭筈豌豆芽苗菜中芦丁含量达(57.38±0.87) mg/kg DW，分别为豌豆苗、黄豆芽及绿豆芽的79.69，260.82，5.89倍。NaCl和CaCl2共同培养的箭筈豌豆芽苗菜中对羟基苯甲酸含量为(5.28±0.14) mg/kg DW，是豌豆苗的6.77倍；其阿魏酸含量是绿豆芽的1.21倍。

综上，箭筈豌豆芽苗菜酚酸种类丰富，芦丁、对羟基苯甲酸含量显著高于豌豆苗、绿豆芽和黄豆芽，氯化钠和氯化钙混合处理后进一步提高了箭筈豌豆芽苗菜的酚酸含量和开发价值。

2.4 酚酸合成关键酶活力与基因表达量变化

2.4.1 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活力与基因表达量变化

由图3可知，NaCl处理下，PAL酶活力由(7.04±0.30) U/g 上升至(8.03±0.58) U/g，PAL1-1、PAL2-1、PAL2-3基因相对表达量分别上升了187.50%，20.70%，119.30%；CaCl2处理下，PAL酶活力略有下降，PAL1-1、PAL2-1、PAL2-3基因相对表达量分别下降了26.30%，75.50%，3.70%；两种盐溶液共同施加时，基因相对表达量大幅下降至最低，而PAL酶活力显著提升至对照组、NaCl处理组、CaCl2处理组的1.36，1.19，1.57倍。

字母不同表示差异显著(P<0.05)图3 PAL酶活力与基因表达量Figure 3 Enzyme activity of PAL and its gene relative expression level

2.4.2 肉桂酸-4-羟化酶(C4H)活力与基因表达量变化

由图4可知，在NaCl处理下，C4H酶活力由(5 025±162) U/g大幅下降至(2 702±87) U/g，C4H基因相对表达量无显著变化；CaCl2处理下，C4H酶活力无明显变化，C4H基因相对表达量下降了23.2%；两种盐溶液共同施加时，C4H酶活力显著上升，达对照组、NaCl处理组、CaCl2处理组的1.15，2.14，1.08倍，但基因相对表达量不到对照组的1/3。

字母不同表示差异显著(P<0.05)图4 C4H酶活力与基因表达量Figure 4 The enzyme activity and relative gene expression of C4H

2.4.3 4-香豆酸：辅酶A连接酶(4CL)活力与基因表达量变化 由图5可知，在NaCl处理下4CL酶活力由(2.39±0.09) U/g上升至(3.59±0.11) U/g，4CL基因相对表达量显著上升了673.90%；CaCl2处理下，4CL酶活力上升，4CL基因相对表达量无显著变化；两种盐溶液共同施加时，4CL酶活力显著上升，4CL基因相对表达量无显著变化。

字母不同表示差异显著(P<0.05)图5 4CL酶活力与基因表达量Figure 5 The enzyme activity and relative gene expression of 4CL

PAL、C4H和4CL是苯丙烷代谢途径的关键酶。PAL非氧化性脱氨生成肉桂酸，C4H催化反式肉桂酸的羟基化反应，生成对香豆酸，对香豆酸然被4CL催化生成香豆酰辅酶A[26]，三者酶活上升能够促进类黄酮代谢阶段合成多酚、黄酮等次级代谢产物。试验表明，在NaCl处理下，箭筈豌豆芽苗菜PAL、C4H、4CL基因相对表达量均发生显著变化，且变化趋势与酶活力变化趋势相同，因此推测Na+是通过调控PAL1-1、PAL2-1、PAL2-3、C4H和4CL基因相对表达，调控mRNA和蛋白的合成，进而调节PAL、C4H、4CL酶合成的数量，实现酶活力的调节。在CaCl2处理下，PAL1-1、PAL2-3、C4H、4CL基因相对表达量未发生显著变化，PAL2-1大幅度下降，其变化趋势与酶活力变化趋势不完全相同，因此推测Ca2+一方面能够通过调控基因相对表达调节PAL、C4H、4CL酶合成的数量，另一方面，Ca2+还能够由胞外向胞内转运，提升胞内Ca2+浓度，Ca2+作为第二信使通过调控信号级联放大，调节PAL单位酶活力。在NaCl—CaCl2体系作用下，PAL、C4H、4CL基因相对表达量为4组中最低而酶活力均大幅上升，因此推测，NaCl—CaCl2体系大大强化了信号级联放大作用，机体单位酶活力显著提升，不需要合成较多酶即可满足需求，所以酶的基因表达量未上升。

2.5 抗氧化酶活力变化

由图6可知，在NaCl和CaCl2共同处理下，APX酶活上升了162.82%，GR酶活上升了125.00%，SOD酶活下降了105.36%，其余酶活力未有显著变化。结果表明，NaCl和CaCl2共同作用激活了APX、GR酶，提升其酶活力来发挥抗氧化作用，POD、GST两种酶活力并未因盐离子而发生显著变化，因此推测酶促抗氧化系统未被完全激活。

2.6 体外抗氧化评价

2.6.1 DPPH自由基体外抗氧化评价 由图7可知，4组处理中，箭筈豌豆芽苗菜游离酚对DPPH自由基的EC50值始终低于结合酚，即游离酚对DPPH自由基的清除能力显著高于结合酚。NaCl+CaCl2处理组箭筈豌豆芽苗菜游离酚对DPPH自由基的清除能力最强，EC50值为1.33 mg/mL。箭筈豌豆芽苗菜游离酚和结合酚分别在0.80～3.15，4.20～8.45 mg/mL 的质量浓度范围内与DPPH自由基清除能力呈正相关，随着浓度的增加，箭筈豌豆芽苗菜游离酚对DPPH自由基的清除能力逐渐上升，清除能力强弱为NaCl+CaCl2处理组> CaCl2处理组> NaCl处理组> 对照组。

2.6.2 ABTS自由基体外抗氧化评价 由图8可知，游离酚对ABTS自由基的清除能力显著高于结合酚，NaCl+CaCl2处理组箭筈豌豆芽苗菜游离酚对ABTS自由基的清除能力最强，EC50值为0.71 mg/mL。箭筈豌豆芽苗菜游离酚和结合酚分别在0.40～1.65，50.00～100.00 mg/mL的质量浓度范围内与ABTS自由基清除能力呈正相关，随着浓度的增加，箭筈豌豆芽苗菜游离酚对ABTS自由基的清除能力逐渐上升，清除能力强弱为NaCl+CaCl2处理组> CaCl2处理组> NaCl处理组> 对照组。

图8 芽苗菜ABTS自由基清除能力Figure 8 ABTS scavenging activity of sprouts

结果表明，箭筈豌豆芽苗菜游离酚的抗氧化性优于结合酚，NaCl和CaCl2单独培养箭筈豌豆芽苗菜均可以提高其抗氧化能力，但两者同施培养的箭筈豌豆芽苗菜对DPPH和ABTS两种自由基均展示出了更高的清除能力，抗氧化能力强弱为NaCl+CaCl2处理组> CaCl2处理组> NaCl处理组> 对照组。

2.6.3 苗菜酚类物质含量与抗氧化性的相关性分析 由表5可知，箭筈豌豆芽苗菜游离态和结合态总酚、总黄酮含量与DPPH自由基和ABTS自由基清除能力呈极显著正相关性。在箭筈豌豆芽苗菜中，APX、GR与DPPH自由基、ABTS自由基清除能力呈正相关，CAT、POD与DPPH自由基和ABTS自由基清除能力基本无相关性，而SOD与酚类提取液的DPPH自由基、ABTS自由基清除能力呈显著负相关。

表5 酚类物质、抗氧化酶与抗氧化性之间的相关性†Table 5 Correlation of phenolic content, antioxidant enzyme and antioxidant capability

结果表明，酚类物质和酶促抗氧化系统共同发挥了抗氧化作用，与唐文文等[27]、Chen等[28]的研究结果一致。箭筈豌豆芽苗菜酚类物质含量与抗氧化能力显著正相关，因此NaCl和CaCl2可以通过提升酚类物质含量进一步提高箭筈豌豆芽苗菜的抗氧化能力。Na+和Ca2+激活了APX和GR酶促系统，通过提升单位酶活力提升了APX和GR清除自由基的能力，进而提高了芽苗菜抗氧化能力；DPPH自由基和ABTS自由基清除能力与CAT、POD无相关关系，甚至与SOD酶活力呈显著负相关，推测贡献箭筈豌豆芽苗菜抗氧化性的主要是非酶促抗氧化系统中的酚类物质，酚类物质和APX、GR酶促抗氧化能够平衡箭筈豌豆芽苗菜在生长5 d过程中产生的自由基，能够满足机体需要，因此酶促抗氧化系统未被完全激活。

3 结论

试验表明，15 mmol/L NaCl会抑制箭筈豌豆芽苗菜生物量的积累，0.5 mmol/L CaCl2能够促进其生长，二者单独施用时均能够富集酚类物质，增强抗氧化能力。将15 mmol/L NaCl和0.5 mmol/L CaCl2混合施用于箭筈豌豆芽苗菜时，Ca2+缓解甚至解除了Na+带来的生物胁迫作用，二者通过提高PAL、C4H和4CL酶活力促进了对香豆酸、槲皮素、山奈酚、芦丁、阿魏酸、木犀草素、原儿茶酸等酚类物质的富集，酶促抗氧化系统被部分激活，箭筈豌豆芽苗菜展现出了更高的抗氧化能力。芦丁是箭筈豌豆芽苗菜酚酸的优势成分，含量为(22.50±0.49) mg/kg DW，经两种盐离子作用，芦丁含量富集到(57.38±0.87) mg/kg DW，约为豌豆苗、黄豆芽及绿豆芽的79.69，260.82，5.89倍。

NaCl、CaCl2共同作用下能够提高茎长，但对粗细无显著影响，后续可以尝试其他盐离子与NaCl、CaCl2混用，进一步提高箭筈豌豆芽苗菜的生物量；也可以就箭筈豌豆芽苗菜丰富的酚类物质开展动物试验，进行体内评价，或提取芦丁等优势成分开展功能性评价。