QuEChERS-UHPLC-MS/MS法测定黑木耳中米酵菌酸残留量

黄永桥 马 凯 吴新文 高 亮 简银池 路 瑶 杨昌彪

(1. 贵州省检测技术研究应用中心，贵州 贵阳 550014；2. 贵州省分析测试研究院，贵州 贵阳 550014)

米酵菌酸(Bongkrekic Acid)是椰毒假单胞菌属酵米面亚种产生的一种可以引起食物中毒的毒素，毒性较强，误食后会损坏人的脑、肝脏及肾等器官，严重者可致死亡[1-2]，其化学结构式如图1所示。

图1 米酵菌酸的化学结构式Figure 1 The chemical structure formula of bongkrekic acid

近年来，中国因米酵菌酸引起的食物中毒事件时有发生[3-5]。黑木耳本身无毒，但长时间浸泡会变质滋生细菌、真菌等致病微生物，进而产生生物毒素(米酵菌酸)，危害人体健康。目前，中国现行的相关标准中只规定了银耳中米酵菌酸含量≤ 0.25 mg/kg[6-7]，现行的米酵菌酸检测标准中检出限为0.005 mg/kg[8]，且标准适用范围为银耳及其制品、酵米面及其制品等食品，而黑木耳未在其检测范围内且限量不明确。

目前，有关米酵菌酸含量检测的方法有薄层色谱法[9]、紫外分光光度法[10]、高效液相色谱法[11-12]、液相色谱—串联质谱法[13-15]、高分辨质谱法[16]。薄层色谱法和紫外分光光度法操作简单，但易受其他杂质的干扰；高效液相色谱法通用性强，但灵敏度低；液相色谱—串联质谱法因具有灵敏度高、抗干扰能力强等优点，被广泛用于痕量分析。而有关黑木耳中米酵菌酸含量的测定方法尚未见报道。QuEChERS法作为近年来新开发的一种快速、简便的前处理方法，被广泛用于农兽药残留及其他痕量化合物的测定[17-20]。

研究拟以黑木耳为研究对象，采用QuEChERS净化方法，建立QuEChERS结合UHPLC-MS/MS仪快速测定黑木耳中米酵菌酸含量的检测方法，旨在为黑木耳的质量控制提供一种更加快速、简便的检测方法。

1 材料与方法

1.1 试验仪器和试剂

超高效液相色谱仪：Agilent 1290型，配ZORBAX Eclipse Plus C18(50 mm×2.1 mm, 1.8 μm)，美国安捷伦科技有限公司；

三重四级杆串联质谱仪：6470型，配有电喷雾离子源，美国安捷伦科技有限公司；

多管涡旋混合器：UMV-2型，北京普立泰科公司；

纯水机：Milli-Q型，美国Millipore公司；

陶瓷均质子：北京迪科马科技有限公司；

C18吸附剂：40～63 μm，上海安谱实验科技股份有限公司；

无水硫酸镁：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；

甲醇、乙腈：色谱级，德国Merck公司；

氨水：分析纯，山东西亚化工科技有限公司；

乙酸铵(质量分数25%～28%)：色谱纯，山东西亚化工科技有限公司；

米酵菌酸：≥95%，美国Sigma公司；

黑木耳：试验前于30 ℃下恒温避光浸泡48 h，市售。

1.2 标准溶液配制

1.2.1 标准储备液配制 将米酵菌酸标准品配制成1.0 mg/mL标准储备液，于-18 ℃避光保存。

1.2.2 基质工作曲线配制 将样品前处理后得到的空白基质提取液，分别配置成0.50，1.00，2.00，4.00，8.00，10.00 ng/mL基质标准工作液，现配现用。

1.3 色谱条件

柱温35 ℃；进样量5 μL；流动相A为2 mmol/L乙酸铵(含0.1%甲酸溶液)，流动相B为乙腈；流速0.3 mL/min；洗脱梯度：0.0～0.5 min，10% B；0.5～1.5 min，10%～85% B；1.5～2.0 min，85% B；2.0～2.5 min，85%～10% B；2.5～4.0 min，10% B。

1.4 质谱条件

ESI源；负离子扫描；MRM扫描；毛细管电压4.0 kV；雾化器压力275.8 kPa；干燥气和鞘气流速10 L/min；干燥气和鞘气温度300 ℃；母离子m/z485.2，锥孔电压80 V，定量离子m/z441.3，碰撞能量8 eV，定性离子m/z397.3，碰撞能量18 eV。

1.5 样品前处理

称取浸泡粉碎后的试样5.00 g于塑料离心管中，加入10 mL 1%氨水—甲醇溶液，涡旋振荡10 min，5 000 r/min离心10 min，吸取上清液2 mL于预先加有500 mg无水硫酸镁和50 mg C18吸附剂的离心管中，涡旋1 min，5 000 r/min离心2 min，取上层清液过膜，待测。

1.6 方法学评价

1.6.1 基质效应 采用基质标准曲线和纯溶剂标准曲线，并按式(1)计算基质效应(ME)。

ME=[(k1/k2)-1]×100%，

(1)

式中：

ME——基质效应，%；

k1——基质匹配标准曲线斜率；

k2——纯溶剂标准曲线斜率。

通常ME>0%为基质增强效应；ME<0%为基质抑制效应。当|ME|≤10%时，可忽略不计；当|ME|为10%～20%时，存在较弱的基质效应；当|ME|>20%时，存在强基质效应[21]。

1.6.2 检出限及定量限 通过在阴性样品中添加标准溶液来考察方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ)。

1.6.3 回收率及精密度 选取阴性样品进行加标回收试验，添加水平分别为2，4，10 μg/kg，每个水平重复6次，计算回收率和精密度。

1.6.4 数据处理 采用Excel 2016软件对数据进行处理，使用Origin 2018软件绘图。

2 结果与分析

2.1 色谱条件优化

米酵菌酸结构式中含有3个羧基(—COOH)，酸性较强，当采用乙腈—水作为流动相时，其峰形、响应值和分类效果均优于甲醇—水。当在水相中加入2 mmol/L乙酸铵时，其峰形得到明显改善，因此，选择乙腈—0.1%甲酸(含2 mmol/L乙酸铵溶液)作为流动相，采用梯度条件洗脱。

2.2 质谱条件优化

采用接双通的方式，用100 μg/L的标准溶液进样优化分析，在负离子模式下使用一级全扫描得m/z为485.2的准分子离子([M-H]-)，通过优化锥孔电压进行二级质谱分析，得到m/z为397.3，441.3的特征碎片离子。

2.3 前处理条件优化

2.3.1 提取 选择乙腈、0.1%甲酸—乙腈、1%氨水—乙腈、甲醇、0.1%甲酸—甲醇和1%氨水—甲醇作为提取溶剂，结果见图2。由图2可知，当使用1%氨水—乙腈作提取溶剂时，米酵菌酸提取效率为34.9%，明显低于其他几种溶剂；当使用乙腈、0.1%甲酸—乙腈、甲醇和0.1%甲酸—甲醇作提取溶剂时，其提取效率相差较小，均<70%；当使用1%氨水—甲醇作提取溶剂时，其提取效率为87.6%，高于其他几种提取溶剂，且满足要求。故选用1%氨水—甲醇作为提取溶剂。

图2 提取溶剂对米酵菌酸回收率的影响Figure 2 Effects of different extraction solvents on the recovery of bongkrekic acid (n=3)

2.3.2 净化 选择C18吸附剂、PSA吸附剂、GCB吸附剂和Oasis PRiME HLB小柱进行考察，结果见图3(a)。由图3(a)可知，使用PSA和GCB吸附剂作净化材料时，目标物的吸附较多，回收率<20%；使用C18吸附剂和Oasis PRiME HLB小柱时，回收率均满足要求，但C18吸附剂的回收率略优于Oasis PRiME HLB小柱，且杂质干扰、基线噪声等优于Oasis PRiME HLB小柱。由图3(b)可知，使用50 mg C18吸附剂的回收率优于其他两种。因此，选择50 mg C18吸附剂作为净化方法。

图3 净化方法及C18吸附剂用量对回收率的影响Figure 3 Effects of different purification methods and the amount of C18 adsorbent dosage on recovery (n=3)

2.4 方法学评价

2.4.1 基质效应 由表1可知，基质效应为21.8%，说明米酵菌酸在木耳基质中存在较强的基质增强效应，为减弱或消除基质效应对结果的影响，采用基质匹配标准曲线进行定量分析。

2.4.2 方法的标准曲线和检出限 由表1可知，米酵菌酸在0.50～10.00 ng/mL的质量浓度范围内，相关系数(r)为0.998 3，线性关系良好，检出限为2.0 μg/kg。

表1 线性范围、线性方程、相关系数、检出限及基质效应Table 1 Linear range, Linear equation, correlation coefficient (r), limits of detection (LOD) and matrix effects (ME) of bongkrekic acid

2.4.3 回收率及精密度 由表2可知，3个添加水平的日内平均回收率为74.4%～91.6%，日内相对标准偏差(RSD)为6.0%～9.2%；日间平均回收率为74.9%～89.4%，日间相对标准偏差(RSD)为3.3%～4.3%。说明试验方法具有较好的重复性与准确性，可用于木耳中米酵菌酸残留量的定性、定量分析。

表2 加标回收率和精密度Table 2 Recoveries of standard addition and precisions of bongkrekic acid

标准溶液、空白样品及加标样品的总离子流图如图4所示。

图4 米酵菌酸标准溶液、黑木耳空白样品、黑木耳 加标样品总离子流图Figure 4 TIC chromatograms of standard solution, blank sample of auricularia auricula and bongkrekic acid spiked sample of auricularia auricular

2.5 样品测定

按试验建立的方法对浸泡48 h后的10批次黑木耳进行测定，每个样品平行测定2次，结果均未检出米酵菌酸。由于试验是在冬季进行的，故未能反映不同季节环境条件对黑木耳浸泡的影响。

3 结论

建立了QuECHERS结合UHPLC-MS/MS法快速测定木耳中米酵菌酸残留量的检测方法，并对建立的方法进行方法学验证。结果表明，试验方法前处理简单、快速、灵敏度、精密度和分析准确性均满足相关要求，且方法检出限低于现有检测标准，单个样品分析时间为4 min，能够快速、准确定性和定量分析木耳中米酵菌酸残留量，为日常监管提供技术支持。后续可研究黑木耳中产生米酵菌酸与浸泡时环境条件的关系，以揭示米酵菌酸在浸泡过程中的产生机理。