基于液相色谱-质谱法脂质组学研究德州驴肌肉的脂质组成

李孟孟，宋英华，刘宝秀，薛 鹏，任 薇，柴文琼，刘桂芹，朱明霞，王长法*

（聊城大学农学院，聊城毛驴高效繁育与生态饲养研究院，山东 聊城 252000）

驴（）属马属，是许多国家重要的经济家畜，为人类提供皮（主要用于熬制阿胶）、奶和肉类。“天上龙肉，地上驴肉”，不仅赞美驴肉的美味，更表明驴肉的营养价值和独特之处。研究表明，与猪、牛和羊肉相比，驴肉不仅肉质红嫩鲜美、纤维细腻、口感劲道，且蛋白质及其必需氨基酸丰富。此外，驴肉中脂肪、胆固醇含量和热量较低，而多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFA）含量丰富，深受一些消费者喜爱，具有较高的开发和利用价值。驴肉是我国传统饮食，特色地方驴肉小吃有河间驴肉火烧、保定驴肉卷、东阿驴肉饺子、广饶腊驴肉、高唐驴肉和南京五香驴肉等。近年来，驴肉消费在我国越来越流行，尤其在山东、山西和河北。因此，深入解析驴肉的营养价值，尤其是脂质组成，对驴肉提质增效具有重要实际意义。

研究表明，食物中PUFA在抗炎、降脂和预防心血管疾病方面发挥重要作用。研究报道驴肉的肌内脂肪（intramuscular fat，IMF）占2%～4%，且含有较高的单不饱和脂肪酸和PUFA等。另外，IMF是肉品质的重要影响因素，与肉的风味、多汁性和嫩度直接相关。因此，研究驴肉IMF的种类、含量、分布以及优势脂质等对认识其营养价值和优质肉生产具有重要实际意义。然而，目前缺乏驴肉脂质组成的系统报道，特别是中国地方特色驴种，如德州驴。德州驴主要分为三粉驴和乌头驴2 个品种，在产皮、肉和奶方面表现出巨大潜力。此外，德州驴由于适应性和抗病能力强、耐粗饲等特点，在我国已广泛饲养。鉴于此，本实验以德州三粉驴和乌头驴为研究对象，基于液相色谱-质谱（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）法脂质组学对驴肉脂质和脂肪酸组成、差异脂质、潜在生物标记物和代谢途径进行系统研究，旨在为清晰认识德州驴肉营养价值和开发其肉制品提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

在山东省聊城市当地农户养殖场选择体质量相近、饲养管理一致的2 岁龄左右德州三粉和乌头公驴各5 头。全部驴饥饿12 h后被转运到当地屠宰场（山东东阿天龙食品有限公司），按照常规屠宰程序进行屠宰。屠宰后，取背最长肌立即置于液氮中速冻，贮存在－80 ℃冰箱中用于脂肪酸组成和脂质组学分析。三粉驴和乌头驴样品分别记作SF和WT。

氯仿、甲醇、氢氧化钾、乙腈和甲酸铵 赛默飞世尔科技（中国）有限公司；三氟化硼-甲醇溶液 上海安谱实验科技股份有限公司；CRM47885 37 种C～C混合标准品 西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；0.22 μm滤膜 生工生物工程（上海）股份有限公司；异丙醇 天津祥瑞鑫化工科技有限公司。

1.2 仪器与设备

FW100粉碎机 天津泰斯特仪器有限公司；FD5-3T GOLD-SIM冷冻干燥机 美国金西盟国际集团；7890B气相色谱仪（配有氢火焰离子化检测器）、CP7487毛细管柱（60 mh0.25 mm，0.20 μm）、气相化学工作站软件、1290 LC仪 美国安捷伦有限公司；Scientz-48高通量组织研磨仪 宁波新芝生物科技股份有限公司；5305真空浓缩仪、5424冷冻离心机 德国艾本德股份公司；Kinetex C色谱柱（2.1 mmh100 mm，1.7 µm） 美国飞诺美公司；TripleTOF 6600 plus MS仪 美国应用生物系统公司。

1.3 方法

1.3.1 脂肪酸测定

肌肉样品在－80 ℃冷冻干燥机中冷冻干燥后，使用粉碎机研磨成肉粉，放在－80 ℃冰箱中备用。样品总脂质提取采用氯仿-甲醇法（2∶1，/），肌肉脂肪酸测定方法依据前期研究报道的方法。脂质使用0.50 mol/L KOH-甲醇溶液和15%三氟化硼-甲醇溶液在70 ℃水浴下转化为脂肪酸甲酯，待气相色谱分析。进样1 μL，柱烘箱温度在140 ℃保持5 min，并以4 ℃/min升高到220 ℃，保持10 min。通过与37 种C～C混合标准品对比鉴定样品中各种脂肪酸。最后使用气相化学工作站软件对脂肪酸进行分析，各种脂肪酸以占总脂肪酸含量的百分比表示。

1.3.2 LC-MS分析

样品脂质提取前处理依据前期相关研究报道的方法，并稍作修改。取约100 mg样品于2 mL匀浆管中，加入750 μL氯仿-甲醇混合溶液（2∶1，/）和1 颗3 mm钢珠，放入高通量组织研磨仪中60 Hz研磨120 s；样品在冰上提取2 h，每30 min涡旋振荡30 s；在4 ℃、10 000h离心15 min，所得上清液在真空浓缩至干；样品溶解于200 μL异丙醇，0.22 μm滤膜过滤后于－20 ℃冰箱中贮藏备用。

LC条件：C色谱柱（2.1 mmh100 mm，1.7 µm）；自动进样器温度8 ℃；柱温55 ℃；流动相A：乙腈-水（40∶60，/，含10 mmol/L甲酸铵）；流动相B：异丙醇-乙腈（90∶10，/，含10 mmol/L甲酸铵）；流速0.30 mL/min。梯度洗脱程序：0～1.5 min，60% A、40% B；1.5～10.5 min，60%～15% A、40%～85% B；10.5～14 min，15% A、85% B；14～14.1 min，15%～0% A、85%～100% B；14.1～15 min，0% A、100% B；15～15.2 min，0%～60% A、100%～40% B；15.2～18 min，60% A、40% B。

MS条件：电喷雾离子源；正模式进样体积2 μL，负模式进样体积6 μL；离子源雾化气压力50 psi；辅助气压力50 psi，气帘气压力30 psi，离子源温度600 ℃，正、负模式电压分别为5 000 V和－4 500 V；去簇电位100 V。采用数据相关采集方法，每个采集周期包括一个快速飞行时间质谱（time of flight mass spectrometry，TOF MS）扫描（200 ms），然后连续采集11 个子离子扫描（每个50 ms）。TOF MS扫描质量范围为200～2 000 Da，碰撞能量10 eV。子离子扫描范围100～2 000 Da，碰撞能量（45f25）eV。采用动态背景排除法去除无必要的MS/MS信息。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 德州三粉驴和乌头驴肌肉脂质和脂肪酸组成

由图1可知，将原始数据通过脂质结构数据库/进行检索，2 种驴肉均鉴定出1 101 种脂质分子属于13 个亚类，包括20.65%（脂质分子数量占比，下同）甘油三酯（triglyceride，TG）、5.91%甘油二酯（diacylglycerol，DG）、0.09%甘油一酯（monoglyceride，MG）、26.64%磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine，PC）、16.74%磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）、7.91%磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol，PG）、6.41%磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）、2.83%磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）、1.35%磷脂酸（phosphatidic acid，PA）、5.83%神经酰胺（ceramides，Cer）、4.08%鞘磷脂（sphingomyelin，SM）、0.26%鞘氨醇（sphingosine，Sph）和0.42%磺胺肽（sulfatide，ST）。分析德州三粉驴和乌头驴肌肉中主要脂质发现，TG为优势脂质，其次是磷脂（PC、PE、PG和PI）；TG、PC、PE、PG、PI、PS、溶血磷脂酰胆碱（lysophosphatidylcholine，LPC）、溶血磷脂酰乙醇胺（lysophosphatidylethanolamine，LPE）和SM的相对含量在2 种驴肌肉中均无显著差异（＞0.05）；而DG相对含量在三粉驴肌肉中显著高于乌头驴（＜0.001）（图1B）。另外，脂肪酸C、C和C分别为2 种驴肌肉最主要的饱和脂肪酸（saturated fatty acids，SFA）、单不饱和脂肪酸（monounsaturated fatty acids，MUFA）和PUFA；2 种驴肌肉中脂肪酸C、C、C、SFA、C、C、C、MUFA、C、C、C和PUFA的相对含量均无显著差异（＞0.05）。

图1 德州三粉驴和乌头驴背最长肌脂质和脂肪酸组成Fig.1 Lipid and fatty acid profiles in longissimus dorsi of SF and WT donkeys

2.2 德州三粉驴和乌头驴肌肉差异脂质分子

由图2可知，OPLS-DA评估德州三粉驴和乌头驴肌肉的脂质组结果具有明显的区别；置换检验图的和截距值在离子模式下分别为（0.0，0.93）和（0.0，0.04）。如表1所示，共筛选出37 种差异脂质分子（VIP＞1和＜0.05），包括5 种TG、8 种DG、10 种PC、6 种PE、2 种LPE、2 种PG、2 种PI、1 种PS和1 种SM；其中三粉驴与乌头驴相比，32 种上调，5 种下调（图3A）。对差异脂质分子进行ROC分析，结果表明，11 种脂质分子的ROC曲线下面积（area under the ROC curve，AUC）、特异性和敏感性均分别为1、100%和100%（图3B），包括1 种PC（PC(19:2)）、3 种TG（TG(18:3_18:2_16:0)、TG(16:0_16:0_16:0)和TG(20:1_20:1_17:0)）、7 种DG（DG(18:2_18:1)、DG(18:1_16:0)、DG(18:2_16:0)、DG(18:1_18:1)、DG(18:1_18:0)、DG(18:2_18:0)和DG(18:2_18:2)）；其中三粉驴的PC(19:2)和TG(16:0_16:0_16:0)的含量显著低于乌头驴，而其他9 种脂质分子表现为相反的趋势（图3C）。

图2 德州三驴粉和乌头驴背最长肌的脂质组学数据的OPLS-DA评估（A）和置换检验图（B）Fig.2 OPLS-DA score plot (A) and permutation test plot (B) of lipidomic data of longissimus dorsi of SF and WT donkeys

图3 德州三粉驴和乌头驴背最长肌差异脂质分子和潜在脂质标记物Fig.3 Differential lipid molecules and potential lipid markers in longissimus dorsi of SF and WT donkeys

表1 德州三粉和乌头驴背最长肌差异脂质分子的详细信息Table 1 Information on differential lipid molecules in longissimus dorsi of SF and WT donkeys

续表1

2.3 脂质代谢途径

由图4可知，37 种差异脂质分子主要富集在14 条代谢途径，包括花生四烯酸代谢、甘油磷脂代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、-亚麻酸代谢、亚油酸代谢、逆行内源性大麻素信号、糖基磷脂酰肌醇-锚定生物合成途径、阿米巴病、癌症中胆碱代谢、利什曼病、自噬-动物、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、系统性红斑狼疮和自噬-其他。其中，获得5 条与脂质代谢最相关的途径，包括甘油磷脂代谢、亚油酸代谢、糖基磷脂酰肌醇-锚定生物合成途径、-亚麻酸代谢和花生四烯酸代谢。

图4 德州三粉驴和乌头驴背最长肌差异脂质分子功能富集Fig.4 Functional enrichment of differential lipid molecules in longissimus dorsi muscle of SF and WT donkeys

3 讨 论

关于驴肉中脂质组成的研究甚少，但对猪、鸡、羊肉的研究较多。本研究表明，德州三粉驴和乌头驴肉均鉴定出1 101 种脂质分子，属于13 个亚类。这些结果与猪肉（1 180 种脂质）和鸡肉（1 127 种脂质）脂质分子的结果基本一致，却远多于驴乳中的335 种脂质。值得注意的是，驴肉中磷脂分子数量（680多种）占总脂质分子的61.87%，其占比显著高于猪肉（38.31%）和鸡肉（30.90%），这表明驴肉含有丰富种类的磷脂分子。本研究中，德州驴肌肉中TG为优势脂质，占总脂质的75%以上，其次是磷脂（PC、PE、PI、PG和PS）；DG相对含量在三粉驴肌肉中显著高于乌头驴，这可能对于提高肌内脂肪沉积具有重要潜力，由于肌内脂肪主要由TG和磷脂组成，而DG是合成TG和磷脂的重要中间产物。此外，本研究表明，德州驴2 个品种肌肉中，脂肪酸C、C和C分别为其最主要的SFA、MUFA和PUFA，与前期报道的德州三粉驴公驴肌肉具有相似的结论。然而，三粉驴和乌头驴肌肉中所有脂肪酸组成均无显著差异，这可能是由于2 种驴均属于德州驴品系，且实验驴喂食饲料和饲养管理条件一致。

采用OPLS-DA评估德州三粉驴和乌头驴肌肉的脂质数据，二者呈明显分离。OPLS-DA在建模型时对样本进行指定和分组，所得结果可能存在过拟合现象。为进一步阐明OPLS-DA评估的可行性，应用置换检验图评估当前模型是否过拟合，和截距值在离子模式下分别为（0.0，0.93）和（0.0，0.04）。此结果均符合：所有均低于最右原始；回归线纵轴截距小于等于0；OPLS-DA未发生过拟合。这也证实基于LC-MS的脂质组学方法适用于驴肉脂质组成的全面分析。

通过VIP＞1和＜0.05，共筛选出37 种差异脂质分子；三粉驴与乌头驴相比，32 种脂质上调，5 种下调。其中，8 个DG分子相对含量在三粉驴中显著高于乌头驴，这与DG相对含量在三粉驴肌肉中显著高于乌头驴的结果一致。这表明差异DG分子对DG含量起决定作用，在脂质分子水平揭示了三粉驴高DG的机制。DG是生物体内脂肪代谢的内源中间产物，为脂质亚类之一，是多种细胞活动的第二信使，已被证明能加速脂肪酸-氧化，影响脂质代谢相关基因表达，从而降低血清和肝脏中TG水平，加速脂质体内代谢。此外，DG协同增强PS降低胆固醇含量的能力，可用于预防和辅助治疗动脉粥样硬化。本研究共鉴定出65 种DG，三粉驴肌肉富含8 种（脂肪酸组成主要为C、C、C和C），这为驴肉功能脂质开发提供了基础。为进一步筛选区分三粉驴和乌头驴肉的脂质标记物，对37 种差异脂质分子进行ROC分析，共计11 种脂质分子AUC均为1，包括1 种PC、3 种TG和7 种DG。三粉驴中2 种TG（TG(18:3_18:2_16:0)和TG(20:1_20:1_17:0)）和7 种DG（(DG(18:2_18:1)、DG(18:1_16:0)、DG(18:2_16:00)、DG(18:1_18:1)、DG(18:1_18:0)、DG(18:2_18:0)和DG(18:2_18:2)）的含量均显著高于乌头驴，PC(19:2)和TG(16:0_16:0_16:0)的含量显著低于乌头驴。这为2 个品种德州驴肉的区分提供了参考。

基于脂质组学途径分析发现，37 种差异脂质主要富集在14 条代谢途径。花生四烯酸代谢是最显著的代谢途径，其次是甘油磷脂代谢和甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢。根据差异脂质对代谢途径的影响程度，确定甘油磷脂代谢、亚油酸代谢、糖基磷脂酰肌醇-锚定生物合成途径、-亚麻酸代谢和花生四烯酸代谢是最关键的5 条代谢途径。这些相关通路可能与不同品系德州驴肌肉脂质代谢差异最相关。研究报道，猪肉中脂质差异和代谢途径与猪品种有关，与本研究结果一致。此外，研究表明猪肌内沉脂的差异可能由脂肪酸、甘油脂质和甘油磷脂代谢途径差异引起。因此，本研究结果表明驴品种不同导致肌肉脂质代谢途径差异，引起相关脂质分子含量变化，尤其是DG、PC和PE等。

本研究基于LC-MS脂质组学分析不同品种德州驴肌肉脂质组成。在三粉驴和乌头驴肌肉中均鉴定出1 101 种脂质分子属于13 个亚类。德州驴肌肉TG为优势脂质，其次是磷脂（PC、PE和PI），且三粉驴肌肉中含有较高的DG。使用生物信息学筛选出37 种差异脂质分子，进一步筛选出11 种区分2 种驴肉的候选生物标志物和5 条脂质代谢相关途径。本研究深入分析德州驴肉脂质组成，在脂质分子和代谢水平解析德州驴不同品种肌肉脂质的差异，筛选出的差异脂质分子和相关代谢途径可作为区分驴肉的潜在生物标志物，为清晰认识德州驴肉营养价值和开发其肉制品提供基础数据。