小曲清香型白酒中关键风味成分分析

王 喆，张梦思，孙细珍，熊 豆，杨 宏*

（1.华中农业大学食品科学技术学院，湖北 武汉 430070；2.中药保健食品质量与安全湖北省重点实验室，湖北 黄石 435100）

清香型白酒作为我国四大香型白酒之一，因独特的花果香味而受到消费者的广泛欢迎。其中，小曲清香型白酒属于清香型白酒类别，具有醇香清雅，酒体柔和，回甜爽口，纯净怡然的风格特征，这种独特香气风格是由白酒中各类风味物质相互作用而构成的。高级醇、醛类、高级脂肪酸等是小曲清香型白酒中重要风味成分，高级醇也称杂醇油，适量的高级醇有利于白酒风味的形成，如果含量过高，则会增加白酒的苦味和涩味，降低白酒的风味。醛类及高级脂肪酸含量过多则导致白酒就有醛杂味及水嗅味等不良风味。香气是清香型白酒品质好坏的重要参考之一，品质越好的小曲清香型白酒，其香气更加协调。

近年来，随着仪器分析技术的快速发展，气相色谱-嗅闻（gas chromatography-olfactometry，GC-O）技术、固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）和气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）等被广泛应用于白酒中香气成分研究。杜艳红等采用液液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）和SPME方法联用GC-MS检测技术从红星二锅头酒中鉴定出130多种香味物质，拓展了SPME技术在检测白酒香味物质中的应用。Fan Wenlai等使用顶空固相微萃取（headspace solid phase microextraction，HS-SPME）、LLE及GC-MS技术从12 种常见白酒如茅台、五粮液、洋河蓝色经典、郎酒、古井贡、剑南春、四特、汾酒等中共鉴定出27 种吡嗪类化合物。郑翠银等通过HSSPME-GC-O结合时间强度法及香气活度值（odor activity value，OAV）鉴定出了红曲黄酒中41 种香气物质，并且对这些香气物质在陈酿过程中的变化趋势作了阐释。目前对于清香型白酒风味分析的文献较多，但对于明确其香气物质种类、含量与质量等级之间的差异性却少见报道，且小曲清香型白酒行业对原酒质量等级的分级主要是感官品评为主，辅以部分色谱指标进行判断，导致酒体分级受外界干扰较大，因此提高酒体质量分级的准确性与一致性对于指导优化酿造工艺，提升小曲清香型白酒品质具有重要意义。

本研究基于感官定量描述，利用GC-MS-O、HSSPME-GC-MS技术研究2 种小曲清香型白酒中的挥发性物质，并利用芳香萃取物稀释分析（aroma extract dilution analysis，AEDA）法、OAV法鉴定2 种小曲清香型白酒的重要风味化合物，基于定量分析结果利用多元统计学方法对2 种小曲清香型白酒进行差异性分析，从而确定不同质量等级酒体之间的风味物质差异，升级酒体色谱指标分级标准，为进一步优化小曲清香型白酒的生产工艺提供理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

26 个不同质量等级的小曲清香型白酒，其中优级酒和一级酒各13 个，分别标记为JPXQD-1～13和JPXQG-1～13，由劲牌有限公司提供，乙醇体积分数为55%～60%，生产时间为2021年。

1,1-二乙氧基3-甲基丁烷、1,1,3-三乙氧基丙烷、正丙醇、异丁醇、己酸乙酯、辛酸乙酯、异戊酸乙酯、正己醇、苯甲醛（纯度＞98%） 美国SAFC Biosciences公司；2-壬酮、1-辛烯-3-醇、丁酸异戊酯、4-甲基愈创木酚、4-乙基愈创木酚、苯酚、1-壬醇、正构烷烃（C～C）（纯度＞97%） 美国Sigma-Aldrich公司；丁酸异戊酯、乙酸异丁酯、苯乙烯、乙酸苯乙酯（纯度＞98%） 德国CNW Technologies GmbH公司；乙酸乙酯、乳酸乙酯（纯度＞99%） 上海沃凯化学试剂有限公司；对甲酚、4-乙基苯酚（纯度＞95%） 上海安谱实验科技股份有限公司。本实验中所用的标准品均为色谱纯，所用水均为超纯水。

1.2 仪器与设备

AB135-S电子分析天平 美国Mettler-Toledo公司；7890B-5977C GC-MS联用仪、DB-FFAP毛细管色谱柱（60 mh0.25 mm，0.25 μm）、HP-5MS毛细管色谱柱（30 mh0.25 mm，0.25 μm）、CP-WAX毛细管色谱柱（50 mh0.25 mm，0.2 μm） 美国Agilent公司；ODP2嗅闻仪、MPS2三合一自动进样器 德国GERSTEL公司；1 cm 50/30 µm DVB/CAR/PDMS固相微萃取三相萃取头 美国Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 小曲清香型白酒制作工艺

采用东北糯高粱作为原料，在80 ℃水中浸泡20 h，沥干水分，蒸粮约60～90 min，以粮食98%以上开口为宜，摊凉至50 ℃，按0.7%接种观音土曲，接种后的粮食在糖化箱中培菌糖化约24 h，开箱与蒸馏过白酒的酒糟按照1∶2左右的比例配糟，在不锈钢槽车中低温长时间发酵15 d，蒸馏取酒。

1.3.2 挥发性风味成分的定性分析

1.3.2.1 感官评价

参考文献[7-8]和EN ISO 8589《感官分析 试验室设计的一般指南》、GB/T 10345ü2007《白酒分析方法》对小曲清香型白酒样品进行感官评价和质量分级。首先由劲牌公司10 名专业评酒委员（其中国家级评酒委员5 人）对原酒进行分级。通过配制一系列不同香气和不同强度的标准溶液，评价员依次对其进行嗅闻并参照表1进行打分，然后整理出小曲清香型白酒的感官特征描述词，获得8 个主要气味属性（包括水果香、花香、粮食香、甜香、糟香、糠味、酸味、水嗅味）。感官评价在专业的品酒室进行，每轮嗅闻时间为90 s，每轮间隔30 min，感官评价员根据以上8 个气味属性进行强度评价，并将评价结果取平均值，绘制风味剖面图。

表1 感官定量描述评价Table 1 Sensory quantitative description of Xiaoqu mild-flavor baijiu

1.3.2.2 LLE-GC-MS联用法测定

参考Fan Wenlai等的方法并稍作改动，采用LLE提取26 个酒样中的风味成分。具体操作步骤为：取200 mL酒样，用超纯水稀释至体积分数为10%，加入NaCl至溶液饱和，再用70 mL二氯甲烷重复提取3 次，合并有机相，混匀后加入适量无水NaSO静置过夜使溶液脱水，40 ℃氮吹至2 mL，于－20 ℃冰箱中保存备用。

1.3.2.3 GC-MS-O分析

由3 名感官评价员（其中女性1 名，男性2 名，平均年龄为30 岁）组成GC-O嗅闻小组，并对小组成员进行系统的感官培训。取1.3.2.2节中经LLE提取浓缩后的溶液进行分析，具体做法为：将样品利用GC-MS进样后，将鼻子靠近嗅闻仪嗅闻口，记录闻到气味的时间及香味特性。随后将样品进行逐步稀释（稀释倍数为2，其中=0, 1, 2, 3 ），按照同样方法进行嗅闻实验，直到样品进样后无法嗅闻到香气物质。依据挥发性物质的香气特征进行定性分析，并结合AEDA法及香气稀释（flavor dilution，FD）因子对2 组样品中香气物质的强度进行初步的判定。

参考孙细珍等的方法进行仪器分析。

GC条件：DB-FFAP色谱柱（60 mh0.25 mm，0.25 μm）；升温程序：初温50 ℃，以3.5 ℃/min升至220 ℃，保持10 min，再以15 ℃/min升至250 ℃；载气为高纯氦气；流速1.42 mL/min；进样口温度250 ℃。采用HP-5MS色谱柱（30 mh0.25 mm，0.25 μm）；升温程序：初温50 ℃，保持5 min，以3.5 ℃/min升至180 ℃，再以30 ℃/min升至320 ℃，保持10 min；载气为高纯氦气；流速1 mL/min；进样口温度280 ℃。2 种色谱柱的进样量均为1 μL，不分流进样。

嗅闻仪条件：传输线温度250 ℃；嗅闻口温度200 ℃；加湿器流速50 mL/min；流出成分在毛细管末端以1∶1的分流比分别进行质谱和嗅闻。

1.3.2.4 保留指数的测定

参考李研科等的方法，按照上述相同的仪器分析方法分别测定C～C正构烷烃和1.3.2.2节中经LLE的白酒样品溶液，计算出待测化合物的保留指数，并与NIST11.L标准质谱库中的数据进行比对，得到最佳鉴定结果。

1.3.3 定量分析

参考孙细珍等的定量方法进行分析。将GC-O分析中FD因子不小于4的香气成分配制成标准溶液，并稀释成6 个梯度，绘制标准曲线，采用内标法对26 个酒样进行定量分析，化合物质量浓度（C）用平均值表示。

1.3.3.1 GC直接进样分析

翻译与传播学的渊源由来已久，在国外学者的论文和专著中早有论述。翻译理论家奈达（Eugene A.Nida）基于现代信息学和通讯论提出交际理论，认为翻译就是交际，“任何译文如果不发挥交际作用，不能被译文读者看懂，就是不合格且毫无用处的；而要被读者看懂，就必须考虑到语言交际活动的一切相关因素”［1］。德国学者威尔斯（Wolfram Wilss）在其著作《翻译学：问题与方法》中提出，翻译中的“源语—目的语”模式实际上就是传播活动中的“传播者—接受者”模式，而翻译学科发展缓慢正是因为以往的研究忽视了翻译本身的许多特点，特别是有关信息传递的那些特点［2］。

准确移取酒样1 mL于2 mL样品瓶中，加入10 μL三内标使用液（17 028.1 mg/L叔戊醇、16 864 mg/L乙酸正戊酯、12 104.2 mg/L 2-乙基己醇），盖上瓶盖，摇匀，供GC分析。

GC条件：CP-WAX毛细管色谱柱（50 mh0.25 mm，0.2 μm）；载气为高纯氮气，纯度大于99.999%，进样口温度250 ℃，分流比20∶1；流速1.0 mL/min；升温程序：初温35 ℃，保持1 min，以3.5 ℃/min升至70 ℃，再以3.5 ℃/min升至190 ℃，保持15 min；氢火焰离子化检测器（flame ionization detector，FID），温度260 ℃；尾吹气流速25 mL/min；氢气流速30 mL/min；空气流速350 mL/min。

1.3.3.2 HS-SPME-GC-MS分析

取1.5 mL酒样于顶空瓶中，加入6.5 mL纯水，加入10 μL三内标使用液（113.96 mg/L 2-辛醇、114.13 mg/L 2-乙基己醇、109.30 mg/L乙酸香叶酯），再加入NaCl使之饱和，振摇混匀后，采用HS-SPME结合GC-MS进行检测分析。

GC条件：DB-FFAP色谱柱（60 mh0.25 mm,，0.25 μm）；色谱条件同1.3.2.3节；SPME条件：50/30 μm DVB/CAR/PDMS三相萃取头；萃取温度50 ℃；萃取时间30 min；解吸时间2 min；MS条件同1.3.2.3节。

1.3.3.3 OAV计算

本实验中化合物阈值T主要从文献中查阅，暂不考虑风味物质的相互影响，各物质的OAV按下式计算：

式中：C为风味化合物的平均质量浓度/（μg/L）；T为风味化合物的嗅觉阈值/（μg/L）。

1.4 数据统计与分析

使用SPSS 22.0对不同样本进行单因素分析；SIMCA 13.0软件进行主成分分析（principal components analysis，PCA）和偏最小二乘判别分析（partial least squaresdiscriminant analysis，PLS-DA），对以上26 组样品的定量结果进行差异性分析筛选出具有显著差异性的化合物。

2 结果与分析

2.1 小曲清香型白酒感官分析

感官评价小组分别对不同质量等级的小曲清香型白酒从8 个风味属性进行整体评价，结果如图1所示。2 种等级的小曲清香型白酒中最主要的气味特征均为具有较强的水果香、粮食香及花香，并伴随一定强度的甜香和糟香，风格特点上具有相似性，但也存在一定差异。其中，JPXQD的水果、花香等愉悦香气的强度要强于JPXQG；JPXQG中糠味、酸味和苦味明显强于JPXQD。

图1 2 种小曲清香型白酒感官评价Fig.1 Sensory evaluation of Xiaoqu mild-flavor baijiu

2.2 风味成分定性分析

将2 种酒样的萃取浓缩液进行GC-MS分析鉴定，如图2所示。根据谱库检索、保留指数比对、谱库匹配检索、标准品比对和香气特征方法，在JPXQD样品中共鉴定出风味成分95 种，包括51 种酯类、14 种醇类、4 种酸类、6 种醛类、2 种缩醛类、7 种酮类、1 种呋喃类、1 种硫化物、2 种萜烯类、3 种酚类、4 种苯系物；在JPXQG样品中共鉴定出89 种。

图2 JPXQD（a）和JPXQG（b）总离子流图Fig.2 Total ion current chromatograms of volatile compounds in Xiaoqu mild-flavor baijiu, JPXQD (a) and JPXQG (b)

王瑛等通过液液萃取的方法，对牛栏山清香型白酒原酒中风味物质进行鉴定，发现酯类和醇类为其中最主要的风味成分，但由于工艺环境等因素的影响，其种类和数量上存在一定差异。酯类化合物主要呈现花香和果香，醇类化合物主要呈现花香和青草香，酸类化合物主要赋予白酒酸臭味和皮臭味等，醛类物质主要赋予白酒坚果类香味，呋喃类和硫化物主要是异味的来源等。其中2 种样品中的共性成分有89 种，体现了小曲清香型白酒的主要香气特征，说明小曲清香型白酒虽在质量等级上存在差异，但其中的挥发性香气成分在种类方面具有一定的相似性，这可能是小曲清香型白酒中的共性风味成分。

乙酸仲丁酯、乙酸戊酯、异丁基异戊酯、己酸丙酯、醋酸辛酯、乙酸正壬酯等酯类风味成分在JPXQG样品定性分析结果中未检出，而酯类物质是白酒中的主要呈香物质，也是白酒质量鉴定的重要指标，这或许是导致JPXQD白酒在质量等级上高于JPXQG的原因之一。此外，导致2 种酒体之间差异的，可能是少数风味物质或者是共性风味成分中含量的差别。

2.3 2 种小曲清香型白酒的AEDA

通过AEDA对2 组样品中香气物质的强度进行初步判定，FD因子是初始萃取物中香气活性化合物稀释到GC-O能嗅闻到这种香气化合物香气的最大倍数，一般来说FD越大，说明该风味成分在样品中的香气贡献越大。本实验在2 组小曲清香型白酒中共筛选出FD因子不小于4的风味成分共59 种（表2）。从表2可以看出，1,1-二乙氧基-3-甲基丁烷和己酸乙酯均为JPXQD和JPXQG两个样品中影响最大的风味化合物（FD=128）。此外，JPXQD样品中主要的风味成分为丙酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、乙酸异戊酯、醋酸、苯甲醛、甲基壬基甲酮、丁酸苯乙酯、4-甲基愈创木酚（FD=64），异戊酸乙酯、戊酸乙酯、乙酸己酯、庚酸乙酯、二甲基三硫、辛酸异戊酯、月桂酸乙酯（FD=32）。JPXQG中重要的风味成分为二甲基三硫（FD=128），醋酸、丙酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、异戊酸乙酯、乙酸异戊酯、苯甲醛、甲基壬基甲酮、异戊酸、丁酸苯乙酯（FD=64），异丁醇、辛酸乙酯、辛酸异戊酯、苯乙酮、月桂酸乙酯、4-甲基愈创木酚（FD=32）。1,1-二乙氧基-3-甲基丁烷和己酸乙酯是小曲清香型白酒中重要的风味成分。孙细珍等通过对小曲清香型白酒的研究也发现，1,1-二乙氧基-3-甲基丁烷、辛酸乙酯、己酸乙酯、乙酸乙酯等为其特征风味成分，对小曲清香型白酒风味具有较大贡献。1,1-二乙氧基-3-甲基丁烷与2-甲基丁酸乙酯、乙酸乙酯等酯类均具有水果香味、甜香，赋予小曲清香型白酒果香及甜香的味道；酸类主要影响白酒的口感和后味，有呈香、助香，减少刺激和缓冲平衡的作用。醋酸具有一定的醋香味，可以改善口感，使酒体具有爽快感；苯甲醛和甲基壬基甲酮分别具有坚果奶油及柑橘类油脂香味，异丁醇、异戊醇、苯乙醇等醇类多呈水果香和花香，化合物赋予酒体厚重感，是酯类的前驱物质，但这些醇类化合物过量，会给酒体带来不良影响，如上头、口渴等不良反应。以上多种风味成分相互协调，共同赋予小曲清香型白酒的典型风格特点。

表2 2 种清香型白酒中FD不小于4的香气活性物质Table 2 Aroma active compounds with FD ≥ 4 in JPXQD and JPXQG

通过比较2 种不同等级的小曲清香型白酒中FD因子，乙酸丙酯、戊酸乙酯、丙酸异戊酯、乙酸己酯、庚酸乙酯、乳酸乙酯等香气活性物质在JPXQD中的FD值大于在JPXQG中，说明JPXQD中酯类香味成分更加丰富，酒体更为协调，这也与感官评价结果具有一定相似性。此外，正丁醇、异丁醇、丙酸戊酯、二甲基三硫、2-戊基呋喃、1,2,3-三甲基苯、2-壬酮、醋酸、苯乙酮、异戊酸、萘等风味成分在样品JPXQG中FD更高，正丁醇、异丁醇等醇类物质具有溶剂味道及刺激性气味，二甲基三硫带有强烈老咸菜味道，醋酸、异戊酸等带有浓重酸败味道，此类风味物质造成小曲清香型白酒品质和风味的降低，是导致小曲清香型白酒质量差异的重要因素。

续表2

2.4 香气化合物的定量结果

AEDA技术只能分析出单个风味活性物质的相对气味活性，不能确切衡量单一风味活性物质对整体风味的贡献，对于其分析在白酒中的呈香情况还存在一定的局限性。为了进一步明确2 种质量等级的小曲清香型白酒中挥发性成分的差异性，本研究利用GC-FID结合HS-SPME-GC-MS方法对2 种白酒中47 种风味成分进行定量分析，47 种化合物的线性相关系数（）均在0.99以上，定量信息见表3。并结合风味化合物阈值计算所定量化合物OAV。OAV越大的组分对样品总体气味贡献也越大，一般认为OAV不小于1的物质为气味活性物质。

从表3可知，JPXQD和JPXQG中OAV不小于1的香气成分分别为25 种和27 种。在这2 种小曲清香型白酒中，酯类化合物是构成其挥发性香气的重要风味成分（OAV≥1的酯类物质均为13 种）。中国白酒的主要特征以酯香为主，醇类发挥着重要作用。在白酒酿造过程中，酯类通过酯化反应产生，原料、工艺以相同的2 种白酒中酯类风味成分的生成在种类上差别不大，但由于温度、微生物、环境等不稳定的因素，使其在含量和比例上具有一定差异。乙酸乙酯、异戊酸乙酯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、戊酸乙酯、乳酸乙酯在样品优级酒中OAV中均高于一级酒，说明其在前者中对于风味的贡献程度大于后者。此外，某些含量较低的酯类物质，如异戊酸乙酯、戊酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯等，由于阈值较低，对小曲清香型白酒整体风味的构成有重要贡献。OAV不小于1的醇类物质主要包括：异丁醇、正丙醇、异戊醇、仲丁醇，醇类大多具有醇香及水果香味，可使酒体浓厚丰满，是形成酯类化合物的前驱物质，但高级醇含量偏高也是影响中国白酒品质的重要难题。此外，乙醛、己醛也是小曲清香型白酒中的重要香气化合物，但过量醛类会使白酒呈现醛杂味，影响白酒品质。本研究发现醇类、乙基醛类物质在样品JPXQD中的贡献程度均低于JPXQG，这也与感官品评对于2 种小曲清香型白酒质量分级的结果具有一致性，说明定量分析结合OAV测定结合感官品评能有效进行白酒品质评价与质量分级。

表3 2 种清香型白酒中挥发性成分定量参数与定量结果Table 3 Quantitative parameters and results of volatile compounds in JPXQD and JPXQG

续表3

2.5 香气化合物的判别分析

图32 种小曲清香型白酒风味成分PCA（A）和PLS-DA（B）得分图Fig.3 PCA (A) and PLS-DA (B) score plots of aroma compounds in JPXQD and JPXQG

为进一步区分2 种质量等级小曲清香型白酒风味成分的差异性，本研究基于2 种样本的定量结果建立相应的PCA模型，结果如图3A所示。PCA结果显示，JPXQD样品和JPXQG样品无法获得理想的聚类效果，这可能是由于PCA采用无限制条件的降维分析，而2 种样品的香气成分种类具有极大相似性，因此无法有效将2 种样品进行分类。

通过PLS-DA模型将2 种不同等级的小曲清香型白酒明显的区分为2 类。模型分类良好，且模型的解释变量（）和预测能力（）分别为0.92和0.788。从图3B可以看出，2 种小曲酒样品之间的分布具有明显区分，其中，JPXQD样品主要分布在第2象限，但是其聚拢效果相对于样品JPXQG来说比较差，说明JPXQD样品之间存在较大的个体差异，这是由于不同批次的小曲清香型白酒由于环境温度、湿度、微生物等原因，会导致酒体之间的差异性。

图42 种小曲清香型白酒风味成分PLS-DA-VIP值Fig.4 PLS-DA score plots of aroma compounds in JPXQD and JPXQD

PLS-DA是基于PLS法回归的一种判别方式，以预设分组变量，作为有监督的分析，能够弥补PCA方法的不足，强化组间的差异，PLS-DA变异权重参数值（variable importance in projection，VIP）可以量化PLS-DA的每个变量对分类的贡献度，便于筛选重要的特征物质。VIP值越大，变量在不同样本之间差异越显著。如图4所示，VIP值大于1.5的化合物有6 种，主要为乙酸乙酯（VIP=2.132）、乙醛（VIP=2.072）、乙酸（VIP=1.922）、异丁醇（VIP=1.905）、异戊醇（VIP=1.792）、乳酸乙酯（VIP=1.585），它们是2 种不同质量等级小曲清香型白酒间的显著性差异化合物。

此结果与定性和定量分析中结果基本吻合，乙酸乙酯、乳酸乙酯赋予酒体甜香的口感和水果香味，赋予酒体丰满的感觉；醋酸能减少刺激，赋予酒体爽净感，而异丁醇、异戊醇是杂醇油的主要成分，杂醇油具有一定的毒性，含量过高会使人产生头痛、头晕等症状。这些风味成分是2 种质量等级小曲清香型白酒中差异性风味成分，是导致2 种酒体质量差异性的关键因素，也是决定小曲清香型白酒质量的重要评价因素。

3 结 论

基于感官评价定量描述，探索不同质量等级的小曲清香型白酒之间的关键性差异成分，全面剖析了两者香气轮廓与风味成分的差别。通过定性分析发现，2 种小曲清香型白酒，等级上存在差异，但其中的挥发性香气成分在种类方面具有一定的相似性。1,1-二乙氧基-3-甲基丁烷和己酸乙酯均为两个样品中影响最大的风味化合物。乙酯类风味成分在优级酒中的风味贡献度大于一级酒，而部分高级醇类、硫化物、醛酮类、呋喃类等成分在一级酒中的贡献度更高，与感官品评结果具有一致性。乙酸乙酯、乙醛、醋酸、异戊醇、异丁醇、乳酸乙酯是PLS-DA模型中2 种小曲清香型白酒中的显著性差异化合物。优级酒中酯类所包含的水果香、甜香物质香气贡献比一级酒高，醇类、醛类等带来的异杂味物质香气影响低，是导致小曲清香型白酒酒质量差异的重要原因。本研究可为进一步优化小曲清香型白酒的风味品质，提高小曲清香型白酒质量分级准确性和稳定性供一定的理论参考和技术支持。