胆钙化醇饵粒高效液相色谱分析方法研究

王玉萍，雷 琪，付萍萍，马 畅

(陕西省农业检验检测中心，陕西 西安 710003)

1 前言

胆钙化醇灭鼠剂是一种安全性好、可以防治对抗凝血灭鼠剂产生抗药性的新型灭鼠剂，在美国、新西兰等发达国家得到广泛应用，我国也于2012年获得登记[1]。胆钙化醇又名维生素D3，是一种对人类及高等动物生长、发育、繁殖、维持生命和保证健康不可缺少的脂溶性维生素，其主要作用是调节钙、磷代谢，促进肠内钙、磷的吸收和骨质钙化，维持血钙和血磷的平衡，在食品、饲料、医药等领域广泛应用多年[2]。

2 试验部分

2.1 试剂和溶液 甲醇：色谱纯；水：新蒸二次蒸馏水或超纯水；胆钙化醇标样：已知质量分数，ω≥99.9%；胆钙化醇0.075%饵粒。

2.2 仪器 高效液相色谱仪：Agilent 1 260，具有二极管阵列检测器和自动进样器；Agilent色谱工作站；色谱柱：150mm×4.6mm(i.d.)不锈钢柱，内装ZORBAX SB-C18、5μm填充物。

2.3 液相色谱操作条件 流动相：Ψ(甲醇 ：水)=95 ：5，经滤膜过滤，并进行脱气；流量：1.0mL/min；柱温：30℃；检测波长：264nm；进样体积：5μL；保留时间：胆钙化醇约12.6min。典型的胆钙化醇的标样、样品色谱图(图1、图2)。

图1 胆钙化醇标准品液相色谱图

图2 胆钙化醇0.075%饵粒试样液相色谱图

2.4 测定步骤

2.4.1 标样溶液的配制 称取胆钙化醇标样0.05g(精确至0.000 1g)于100mL容量瓶中，用70mL甲醇超声溶解，冷却至室温，用甲醇稀释至刻度并摇匀，用移液管移取上述溶液2.0mL于50mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀。

2.4.2 试样溶液的配制 称取研磨后的3.0g(精确至0.000 1g)胆钙化醇饵粒样品于具塞锥形瓶中，加入70mL甲醇，55℃超声35min，冷却至室温，转移至100mL容量瓶中，多次润洗定容至刻度并摇匀，静置备用。

2.4.3 测定 在上述操作条件下，待仪器稳定后，连续注入数针标样溶液，直至相邻2针胆钙化醇峰面积相对变化<1.2%后，按照标样溶液、试样溶液、试样溶液、标样溶液的顺序进行测定。

2.4.4 计算 将测得的2针试样溶液以及试样前后2针标样溶液中胆钙化醇峰面积分别进行平均。试样中胆钙化醇质量分数按公式(1)计算：

(1)

式中：

ω1——试样中胆钙化醇质量分数，%；

A2——试样溶液中胆钙化醇峰面积的平均值；

m1——胆钙化醇标样的质量，g；

ω——标样中胆钙化醇质量分数，%；

A1——标样溶液中胆钙化醇峰面积的平均值；

m2——试样的质量，g。

f——稀释倍数，f=25。

3 结果分析

3.1 色谱条件选择 色谱柱选择常用的ZORBAX SB-C18反相柱。根据胆钙化醇物化性质和国家标准《GB/T 17818-2010 饲料中维生素D3的测定 高效液相色谱法》，选择甲醇作为溶剂溶解样品，并以甲醇和水作为流动相。为了得到更好的分离效果和峰形，将流动相按不同比例在色谱柱上进行试验，随着甲醇比例的减少，保留时间增加，当甲醇与水比例达到97：3时，有杂质峰干扰胆钙化醇，峰纯度达不到试验要求，最终选择Ψ(甲醇 ：水)=95 ：5作为流动相，流速1.0mL/min。该条件下，胆钙化醇色谱峰峰形较好，与杂质能完全分离，具有良好的精密度和准确度，并且分析时间较短，提高了工作效率。

3.2 检测波长的选择 通过Agilent1260高效液相色谱仪的光谱数据采集功能，经紫外光谱扫描胆钙化醇的最大吸收波长约在210nm和264 nm处，在210nm处灵敏度较高，但干扰较大，在第二大吸收波长264nm处灵敏度尚可，且干扰较小，能够满足分析要求，故将检测波长确定为264 nm(图3)。

图3 胆钙化醇的紫外光谱图

3.3 样品配置过程的优化 由于饵粒制剂的特殊性，样品称取前必须充分研磨，且避光保存，在样品超声过程中，分别对超声温度和超声时间进行了梯度比对，最后确定在55℃超声35min后，样品中胆钙化醇能够充分溶解。

3.4 分析方法的线性相关性试验 按2.4.1标样溶液的制备方法配制6.4～63.7mg/L 5个不同浓度的有效成分线性相关溶液，分别标记为STD1至STD5。在上述操作条件下，待仪器稳定后，按照STD1至STD5的顺序测定每个溶液中胆钙化醇的峰面积，取两次测定的平均结果。以胆钙化醇质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得线性方程为y=25.446x+29.228，相关系数r=0.999 8(图4)。

图4 胆钙化醇线性关系图

3.5 分析方法的精密度试验 按2.4.2试样溶液的制备方法配制5个0.075%胆钙化醇饵粒精密度溶液，以有效成分线性相关溶液STD3为标样溶液，在上述操作条件下，待仪器基线稳定后，按照标样溶液、精密度溶液、精密度溶液、标样溶液的顺序进行测定，结果(表1)。

表1 分析方法的精密度试验结果

3.6 分析方法的准确度试验 称取约1.5g(精确至0.000 1g)胆钙化醇的0.075%胆钙化醇饵粒于100 mL容量瓶中，再分别加入2.4.1中胆钙化醇标准溶液母液约2.0mL，按2.4.2试样溶液的制备方法配制5个有效成分准确度溶液，以线性相关溶液STD3为标样溶液，在上述操作条件下，待仪器基线稳定后，按照标样溶液、准确度溶液、准确度溶液、标样溶液的顺序进行测定，结果(表2)。

表2 分析方法的准确度试验结果

3.7 方法特异性 本试验采用HPLC-DAD峰纯度分析法来鉴别胆钙化醇。胆钙化醇标样、0.075%胆钙化醇饵粒的胆钙化醇HPLC-DAD峰纯度均>990，有效成分处无其它物质干扰，符合定量分析要求。峰纯度色谱图(图5、图6)。

图5 胆钙化醇标样HPLC-DAD峰纯度色谱图

图6 0.075%胆钙化醇饵粒HPLC-DAD峰纯度色谱图

4 结论

本文建立了检测胆钙化醇饵粒中有效成分质量分数的高效液相色谱分析方法。试验结果表明，胆钙化醇在测试浓度范围内线性关系良好，有较高的准确度和精密度，具有分离效果好，分析时间短，操作简便等特点，符合定量分析要求，是一种高效、快速、准确的分析方法。