谷氨酸棒杆菌中基因NCgl2632的敲除和过表达对三种外源蛋白表达的影响

张琦，刘秀霞，杨艳坤，白仲虎*

1(江南大学,工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡,214122)2(江南大学,粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏 无锡,214122)3(江南大学 生物工程学院，江苏 无锡,214122)

谷氨酸棒杆菌是一种来源于土壤的革兰氏阳性菌，由于其无内毒素、胞外几乎无水解酶活性等优点，现在被作为工业生产菌株来发酵生产蛋白质的应用已经越来越广泛。作为一种被广泛应用于蛋白生产的表达宿主，对其蛋白编码基因的改造具有相当高的实际应用前景[1-2]。

在实验室的前期工作中，我们通过转录组数据分析发现了NCgl2632可能是影响谷氨酸棒杆菌能量代谢的关键基因之一[3]，NCBI预测基因NCgl2632预测编码乙酰辅酶A酰基转移酶[4]，乙酰辅酶A酰基转移酶催化蛋白质的酰基化和去酰基化已成为真核生物蛋白质修饰中最普遍的方式之一[5]。乙酰辅酶A乙酰转移酶(acetyl CoA acetyltransferase, AACT)也称为乙酰乙酰辅酶A硫解酶，可以催化2个乙酰-CoA分子的缩合形成乙酰乙酰-CoA[6]。在原核生物中，AACT催化聚羟基丁酸酯(polyhydroxybutyrate, PHB)是生物合成的第一步。来自微生物中乙酰-CoA的常见PHB生物合成包括3个基本酶促步骤：缩合，还原和聚合。乙酰辅酶A酰基转移酶是催化聚羟基丁酸酯合成的第一步。乙酰辅酶A酰基转移酶(3-ketothiolase, PhaA)负责2个乙酰-CoA部分缩合成乙酰乙酰-CoA。乙酰乙酰辅酶A还原酶(acetoacetyl-CoA reductase, PhaB)将乙酰乙酰-CoA还原为3-羟基丁酰-CoA，然后PHB合酶(PHA synthase, PhaC)催化3-羟基丁酰基-CoA的聚合以合成PHB[7]。目前PHB合成途径已在多种原核生物中实现表达，并且能和其他多种产物共同生产[8-10]。而谷氨酸棒杆菌野生型菌株中由于缺乏PHB合成酶基因，无法产生PHB[11]。

蛋白human MutT homolog 1(hMTH1)是一种氧化核苷酸三磷酸的水解酶。细胞中活性氧所产生的氧化性DNA损伤会导致突变或细胞死亡，8-氧代鸟嘌呤(8-oxo-dGTP)是一种主要的氧化性DNA 损伤产物，由于其碱基配对的特性，可引起A∶T到C∶G或G∶C到T∶A的突变[12-13]。hMTH1广泛分布于线粒体和细胞核中，可以水解复制过程中氧化的核苷酸三磷酸，将8-oxodGTP和其他氧化的dNTP水解为单磷酸形式，然后将其排到细胞外基质中，从而防止它们掺入DNA并导致G到T的转化，防止癌细胞中致命的DNA损伤[14-18]。目前，在人体和动物细胞中开发hMTH1抗体以研制针对癌症和肿瘤细胞药物的研究已经非常广泛[19-21]。但是，在原核细胞中关于hMTH1的表达的报道却很少，该蛋白作为1个小分子新型蛋白，同时也有相当的药用潜力，值得在谷氨酸棒杆菌中尝试表达研究。

本研究针对基因NCgl2632进行了过表达和敲除改造，检测了改造菌株中生长曲线和胞内ATP水平的变化，同时检测了表达不同外源蛋白的差异，在此基础上敲除基因NCgl0909进行共同改造，并选取了新蛋白hMTH1进行了表达验证，最终针对双敲除菌株表达该蛋白进行了发酵培养基配比优化。

1 材料与方法

1.1 主要材料

谷氨酸棒杆菌CGMCC1.15647、大肠杆菌DH5α，由本实验室保存；谷氨酸棒杆菌C.g15647ΔNCgl0909，由本实验室构建；本文中所用的引物全部由苏州金唯智公司合成，如表1所列；EcoR I、Hind Ⅲ、XbaⅠ、SmaⅠ等本研究所用到的限制性内切酶，赛默飞世尔科技(中国)有限公司(Thermo Fisher Scientific)；高保真酶PrimerSTAR Max Premix、Ligation连接酶，大连宝生物有限公司(TaKaRa)。

表1 引物序列Table 1 Primers sequence

1.2 敲除菌株的构建

利用同源重组的方法对谷氨酸棒杆菌野生型菌株的目的基因进行敲除。以谷氨酸棒杆菌的基因组为模板，用引物Ko-gene-LF，Ko-gene-LR和Ko-gene-RF，Ko-gene-RR分别扩增左右同源臂。验证条带大小正确无误后，使用纯化试剂盒回收得到左同源臂和右同源臂。再以回收后的左右同源臂为模板PCR扩增，回收得到左右同源臂无缝连接的融合片段。最后双酶切融合片段和载体pK18得到线性化的载体和具有相同黏性末端的同源修复片段，连接后转入大肠杆菌。

1.3 敲除菌株的筛选

(1)将平板上长出的单菌落同时点在LBB+K和LBB+K+蔗糖的平板上进行蔗糖敏感性筛选，在30 ℃培养箱里倒置培养24 h，挑选对应的在LBB+K+蔗糖不长的但在LBB+K上长的菌落，接种于LBB液体培养基，30 ℃培养16 h；

(2)将菌液转接到LBB+蔗糖的液体培养基中，在30 ℃培养16 h后划线到LBB+蔗糖固体平板上；

(3)挑取LBB+蔗糖固体平板上长出来的划线单菌落，分别点到LBB和LBB+K固体平板上，挑选LBB平板上对应在LBB+K上不长的单菌落进行菌落PCR验证；

(4)使用敲除验证引物Ko-gene-LF、Ko-gene-RR作为PCR验证引物，对照为野生型菌株，通过凝胶电泳验证扩增产物的条带大小。

1.4 谷氨酸棒杆菌表达目的蛋白

在30 ℃，220 r/min摇床中培养种子液14 h，按接种量1%转接后加入诱导剂IPTG(终质量浓度为24 g/mL)，培养24 h，收获菌体和上清液用于后续的测定实验。

1.5 发酵样品的SDS-PAGE和Western blot验证

(1)取发酵全菌，破碎上清液分别与5×的Loading Buffer预混合完全，放置于100 ℃的沸水浴中保温5 min，取出后冷却2 min进行电泳，120 V电泳连续跑90 min。结束后倒入考马斯亮蓝染色液进行染色15 min，之后加入脱色液重复脱色直至背景清晰用凝胶成像仪拍照。

(2)根据蛋白Marker的条带和目的蛋白大小切下胶条，采用湿转法进行转膜，放置顺序为负极-滤纸-胶条-聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜-滤纸-正极，切下对应大小的PVDF膜先用甲醇活化5 s，滤纸、胶条、PVDF膜都事先在湿转缓冲液中浸湿，转膜条件为恒流300 mA，90 min。将转好的PVDF膜用TBST洗5 min后加到5%牛奶中置于水平摇床封闭1 h，TBST洗1遍后加到含万分之一抗体的5%牛奶中置于水平摇床孵育1 h，TBST洗3遍，用ECL显色盒进行显色。

1.6 蛋白hMTH1的酶活性检测

本实验所用人8-羟基鸟嘌呤核苷酸酶(hMTH1)酶联免疫吸附测定试剂盒购于江莱生物。取菌体量为10的新鲜收获的发酵液12 000 r/min，离心2 min，弃上清液，菌体用PBS缓冲液洗3次，最后用1 mL的PBS重悬菌体，使用超声波破碎仪破菌，功率为25%，程序设定为每破碎1 s停止2 s，总共破碎6 min至破碎液澄清透明后立即放于冰上，4 ℃，12 000 r/min，离心2 min，取上清液作为待检测的蛋白样品。将准备好的蛋白样品和标准品各50 μL按顺序加入96孔酶标板，然后分别加入带有辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)标记的检测抗体100 μL，并在37 ℃恒温孵育60 min，弃去液体后用洗涤液重复5次洗净酶标板，每孔加入底物后在37 ℃避光孵育15 min。最后加入终止液后在450 nm处测定OD值并绘制曲线，每个实验组有3个生物学重复。

2 结果与分析

2.1 基因NCgl2632的生物信息学分析

对基因NCgl2632进行生物信息学分析，在NCBI的Genbank查询得知该基因长度为561 bp，通过CD seach分析发现没有类似的保守区域，也没有发现跨膜结构域及糖基化位点。通过疏水性分析，发现该蛋白偏向亲水。该基因所编码的蛋白质长度为186个氨基酸，蛋白大小为21 kDa，正负电荷残基总数都为19，理论等电点PI值为7.06，通过蛋白质二维结构分析，发现有47个氨基酸形成α螺旋，占25.27%；12个氨基酸形成β转角，占6.45%；52个氨基酸形成延伸链，占27.96%；75个氨基酸形成无规则折叠，占40.32%。通过swiss-model对该蛋白进行三维建模，结果如图1所示。NCBI对该蛋白的注释为乙酰辅酶A酰基转移酶。

a-蛋白序列分析；b-蛋白二级结构分析；c-蛋白疏水性分析；d-蛋白三级结构建模图1 NCgl2632基因编码蛋白的生物信息学分析Fig.1 Bioinformatics analysis of the protein encoded by the gene NCgl2632

2.2 基因NCgl2632的过表达和敲除对生长水平和胞内ATP水平的影响

分别以质粒pECXK99E为过表达基因的表达载体，质粒pK18 mobsacB为同源重组敲除基因的自杀质粒，成功构建了基因NCgl2632的过表达和敲除菌株。将得到的菌株进行摇瓶培养，对48 h内菌株生长的OD600值和胞内ATP进行测定，同时以谷氨酸棒杆菌野生型和带有质粒pECXK99E的菌株为对照组，结果如图2、图3所示。

由图2可知，基因过表达菌株与加入pECXK99E空载体的野生型对照相比生长曲线差异不大，而基因敲除菌株与野生型对照相比生长稳定期时的最大菌体浓度略有提升。

由图3可知，基因过表达和敲除菌株和对照相比胞内ATP水平都没有明显变化。

图2 NCgl2632基因不同表达水平的菌株生长曲线Fig.2 The growth curve of the mutant strains of the gene NCgl2632注：WT：野生型C.g 15647；ΔNCgl2632:C.g 15647ΔNCgl2632;WT+pECXK99E；加入过表达质粒pECXK99E空载体的野生型C.g 15647；Over-NCgl2632：C.g 15647-Over-NCgl2632(下同)

图3 NCgl2632基因不同表达水平菌株的胞内ATP水平Fig.3 Intracellular ATP level of the mutant strains of the gene NCgl2632

2.3 基因NCgl2632的过表达和敲除对蛋白增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, eGFP)和重链抗体可变区(variable domain of heavy chain antibody，VHH)表达的影响

增强型绿色荧光蛋白eGFP作为最常见的模式蛋白，可以很方便地验证菌株表达外源蛋白的强弱。图4为基因NCgl2632的过表达和敲除菌株表达胞内eGFP得到的荧光强度比较。可以看出过表达基因NCgl2632和加空载的野生型对照相比荧光强度有明显下降，而敲除基因的重组菌株与野生对照相比差距并不大。

图4 NCgl2632基因不同表达水平菌株的胞内eGFP荧光强度Fig.4 Intracellular eGFP fluorescence intensity of the mutant strains of the gene NCgl2632

同时，我们还选取了诱导型VHH蛋白来进行验证。图5为基因NCgl2632的过表达和敲除菌株表达VHH得到的SDS-PAGE和Western blot结果图。

分析结果可以看出，单独敲除基因NCgl2632和野生型相比，表达分泌VHH的能力有明显增强，而过表达基因NCgl2632和加空载的对照相比表达能力略有降低。

M-marker；1-表达VHH蛋白的野生型C.g 15647；2-表达VHH蛋白的C.g 15647ΔNCgl2632；3-表达VHH蛋白的加空载pECXK99E的野生型；4-表达VHH蛋白的C.g 15647-Over-NCgl2632；5-阴性对照图5 SDS-PAGE和Western blot检测NCgl2632基因不同表达水平菌株发酵上清液中VHH的表达情况Fig.5 SDS-PAGE and Western blot for VHH expression in fermentation supernatant of mutant strains with different expression levels of the gene NCgl2632

综上，通过检测基因NCgl2632改造菌株中外源蛋白表达能力的变化，发现过表达菌株表达蛋白的能力并没有提升，而敲除菌株在表达分泌VHH蛋白时表达量提高。因此，我们推测敲除该基因会降低胞内乙酰辅酶A酰基转移酶的含量，从而将浪费在合成乙酰乙酰辅酶A的乙酰辅酶A释放到三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循环中，为合成氨基酸提供更多的底物，从而提升外源蛋白的产量。

2.4 基因NCgl2632和基因NCgl0909的双敲除对VHH和hMTH1的表达影响

在实验室前期工作中分析NCgl0909可能也是影响外源蛋白表达的关键基因之一[3]，而后续的实验表明基因NCgl0909负责编码ABC转运体，参与谷氨酸棒杆菌中特定底物的跨膜转运，并且发现基因NCgl0909的敲除表型比较有利于外源蛋白表达水平的提高[22]。

因此，本实验中同时对基因NCgl2632和基因NCgl0909进行了共同改造，选取了NCgl0909的现有敲除菌株作为出发菌株构建了C.g15647NCgl2632ΔNCgl0909双敲除菌株，并在此基础上构建了VHH的表达菌株。图6为C.g15647NCgl2632和C.g15647ΔNCgl2632ΔNCgl0909表达VHH得到的SDS-PAGE和Western blot结果图。

通过分析得知，双敲除菌株表达分泌VHH的能力比单独敲除NCgl2632和单独敲除NCgl0909的菌株都强。

M-marker；1-阴性对照；2-表达VHH蛋白的野生型C.g 15647；3-表达VHH蛋白的C.g 15647ΔNCgl2632；4-表达VHH蛋白的C.g 15647ΔNCgl0909；5-表达VHH蛋白的C.g 15647ΔNCgl2632ΔNCgl0909图6 SDS-PAGE和Western blot检测基因NCgl2632和基因NCgl0909双敲除菌株发酵上清液中VHH的表达情况Fig.6 SDS-PAGE and Western blot for VHH expression in fermentation supernatant of C.g 15647ΔNCgl2632ΔNCgl0909

为了进一步验证双敲除菌株对外源蛋白表达方面有利影响的普适性，这里选用一种大小为23.5 kDa左右的新蛋白hMTH1进行表达测试。构建了pXMJ19-hMTH1的表达质粒，30 ℃发酵24 h后取全菌和破碎上清液进行了SDS-PAGE和Western blot分析。图7为C.g15647ΔNCgl2632ΔNCgl0909双敲除菌株表达hMTH1得到的SDS-PAGE和Western blot结果图。

根据Western blot结果可以得知，双敲除菌株表达hMTH1的能力比单独敲除NCgl2632和单独敲除NCgl0909的菌株都强。

2.5 hMTH1蛋白活性的检测

使用hMTH1酶联免疫吸附测定试剂盒对改造后谷氨酸棒杆菌中发酵的hMTH1进行活性检测，通过捕获抗体包被微孔板，制成固相抗体，并加入样品与HRP标记的检测抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物显色。底物在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。用酶标仪在450 nm处测定吸光度，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，每个实验组包含3个平行数据，以稀释后的标准样品作为空白对照。如图8所示，最终测出野生型谷氨酸棒杆菌中发酵液的破碎上清液中蛋白hMTH1的活性为32.3 U/L，而双敲除菌株的破碎上清液中蛋白hMTH1的活性为43.4 U/L。

M-marker；1-阴性对照的破碎全菌；2-表达hMTH1蛋白的野生型C.g 15647的破碎全菌；3-表达hMTH1蛋白的C.g 15647ΔNCgl2632的破碎全菌；4-表达hMTH1蛋白的C.g 15647ΔNCgl0909的破碎全菌；5-表达hMTH1蛋白的C.g 15647ΔNCgl2632ΔNCgl0909的破碎全菌;6-阴性对照的破碎上清液；7-表达hMTH1蛋白的野生型C.g 15647的破碎上清液；8-表达hMTH1蛋白的C.g 15647ΔNCgl2632的破碎上清液；9-表达hMTH1蛋白的C.g 15647ΔNCgl0909的破碎上清液；10-表达hMTH1蛋白的C.g 15647ΔNCgl2632ΔNCgl0909的破碎上清液图7 SDS-PAGE和Western blot检测基因NCgl2632和基因NCgl0909双敲除菌株发酵全菌和破碎上清液中hMTH1的表达情况Fig.7 SDS-PAGE and Western blot for hMTH1 expression in fermented bacteria and crushed supernatant of the gene NCgl2632 and gene NCgl0909 co-knockout strain

阴性对照-稀释过的标准样品；WT+hMTH1-表达hMTH1的野生型C.g 15647；ΔNCgl2632ΔNCgl0909+hMTH1-表达hMTH1的C.g 15647ΔNCgl2632ΔNCgl0909图8 双敲除菌株的破碎上清液中蛋白hMTH1的活性Fig.8 Enzyme activity of protein hMTH1 in the crushed supernatant of the co-knockout strain

2.6 hMTH1蛋白的发酵培养基配比优化

通过上述实验可以得到用NCgl2632和NCgl0909双敲除菌株表达hMTH1蛋白的产量相比野生型有较大提高，可以在此菌株的基础上对发酵培养基进行进一步优化，以得到更高的蛋白表达量。谷氨酸棒杆菌细胞生长和外源蛋白的表达需要合适的培养基碳氮浓度和碳氮比，碳氮比过高可能会导致代谢不平衡，碳氮比过低容易导致菌体自溶。

通过筛选，确定了葡萄糖、玉米粉作为碳源，硫酸铵、尿素作为氮源，对选定的4个因素，设定了2个浓度梯度水平，分别是葡萄糖质量浓度80、120 g/L，玉米粉质量浓度5、10 g/L，硫酸铵质量浓度20、30 g/L，尿素质量浓度0、10 g/L。使用JMP软件中的定制设计对4个因子2个水平进行实验设计，得到12组实验组合，以终生物量OD600值和单位OD值目标蛋白hMTH1的相对蛋白量为响应变量。

按照设计配制不同营养成分配比的培养基，不同培养基中分别接种C.g15647ΔNCgl2632ΔNCgl0909-hMTH1，30 ℃，200 r/min，发酵48 h后取样分别测定菌体OD600值，结果如表2所示。取菌体量OD值为10的菌液进行破碎，取破碎液上清液进行Western blot检测，使用ImageJ软件对Western blot结果进行灰度分析，计算得到单位OD值的hMTH1蛋白量，结果如表2所示。第1种模式的情况下菌体的OD600值最高，为12.4，且单位OD值下的hMTH1蛋白量最高为1.875。对照组为使用基础LBB培养基在相同的培养温度和培养时间下培养的相同改造菌株，对照组的OD600值为9.68，单位OD值的蛋白表达量为1，第1种模式下的hMTH1蛋白表达量是对照组的1.875倍。

表2 培养基成分优化参数实验Table 2 Experimental of optimization parameters of medium composition

用JMP软件对结果进行标准最小二乘法拟合模型分析，可得到参数估计值如表3所示，概率表征了各因素对结果的影响程度，当概率<0.05时为显著影响，当概率<0.01时为极显著影响。由表3可知尿素的概率为0.002 7，说明影响效果最为显著，葡萄糖概率为0.150 5，效果第二显著，玉米粉的t比为负数说明与结果负相关，同时概率最大为0.874 7说明影响最不显著。

表3 培养基成分优化参数筛选结果Table 3 Medium component optimization parameter screening result

由图9培养基成分优化参数预测图可知，葡萄糖含量增加对响应值有不明显的增加，而尿素则会对2种响应值有较强的正向促进影响，玉米粉和硫酸铵的浓度增加对OD值和蛋白量的影响都很微弱。

综上，培养基的成分配比可以确定为葡萄糖质量浓度为120 g/L，玉米粉质量浓度5 g/L，硫酸铵质量浓度30 g/L，尿素质量浓度10 g/L。选用优化后的培养基进行hMTH1的发酵，宿主菌为C.g15647ΔNCgl2632ΔNCgl0909，发酵条件为100 mL培养基在30 ℃、220 r/min下摇瓶培养48 h。使用hMTH1酶联免疫吸附测定试剂盒对菌体的破碎上清液进行检测发现hMTH1的活性为60.2 U/L。

图9 培养基成分优化参数预测刻画图Fig.9 Medium composition optimization parameter prediction characterization

3 讨论

基因NCgl2632的单独改造对谷氨酸棒杆菌的发酵过程中生理参数的影响并不大，但这并不能说明该基因对谷氨酸棒杆菌基因组的优化毫无作用，该基因编码的乙酰辅酶A酰基转移酶虽然会影响胞内乙酰辅酶A的含量，进而会使TCA循环的乙酰辅酶A通量产生变化，但由于细胞本身的代谢调控机制过于复杂，少量代谢中间物的通量变化可能会由别的通路代偿；而谷氨酸棒杆菌野生型菌株中由于缺乏PHB合成酶基因，无法产生PHB，所以乙酰辅酶A酰基转移酶所催化的PHB合成反应在野生型菌株中是被阻断的，因此该基因改造后的表型的整体生长状态差别不大，但通过几种不同的外源蛋白表达来进行验证后发现，总体来说可以推论敲除基因NCgl2632对类似大小的外源蛋白产量提升是有有利影响的。

同时由于实验室的前期工作中发现了NCgl0909的敲除表型也是有利于外源蛋白产量提升，因此我们构建了2个基因的共敲除菌株以获得更优蛋白表达宿主，并选择了新蛋白hMTH1在多基因改造菌株对蛋白表达影响的普适性进行了验证，最终对发酵培养基进行了优化得到了最适合双敲除菌株表达hMTH1的发酵培养基配比。

但是本文的研究存在很多不足，例如：虽然我们知道了敲除基因NCgl2632对蛋白表达有一些有利影响，但是并没有深入研究具体的代谢调控机制，只能针对结果进行相应的分析。此外，由于实验条件的限制，本文只是将hMTH1在胞内上清液中进行了可溶表达，如何将它分泌出胞外并增大该蛋白的表达量有待在接下来的实验中近一步研究。