肉桂精油的化学成分分析及其对沙门氏菌细胞膜损伤机制的研究

陈雪琴，赵圆圆，张珍*，吴佩君，李雯，杜建明，张生祥，王鹏，王丽

1(甘肃农业大学 食品科学与工程学院，甘肃 兰州，730070)2(兰州市西固区市场监督管理局，甘肃 兰州，730060)

随着全球人口的迅速增长，人们对于食物的需求量大幅增加，越来越多的食品安全问题被推上风口浪尖，因此食品安全问题已经成为当今社会所面临的重要挑战之一。世界卫生组织(World Health Organization，WHO)报告显示，沙门氏菌(Salmonellaenterica)位于食源性致病菌的前列，全球大部分地区都存在着不同程度的S.enterica污染问题，这严重威胁到公众健康，并导致严重的经济损失[1]。S.enterica属于肠道菌科，广泛存在于自然界中，是一种有鞭毛，无芽孢，经染色后呈红色的革兰氏阴性微生物，大多数S.enterica能引起伤寒、副伤寒以及食物中毒等，其可导致败血症、胃肠炎和肠热症三类疾病，且都是通过食物传播引起的，其中动物性食品占大部分[2]。虽然化学防腐剂被广泛开发使用，但却给人类身体健康带来较大的危害，因此选择开发绿色天然的抑菌物质具有重要意义。

目前，香辛料精油已被广泛用于食品的防腐保鲜。我国的植物资源丰富，这为植物精油的开发和利用提供了有利条件。植物精油是一种从植物的分泌组织中提取的具有一定生物活性的挥发性油状物质，其成分复杂，由几十种至数百种化合物组成[3]。研究表明植物精油对几种重要的食源性致病菌(S.enterica、单核细胞增生李斯特菌、弯曲杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157∶H7等)均有明显的抑制作用[4]。肉桂是双子叶樟科植物，其皮、叶等各种组织中含有大量的挥发油、黄烷醇、多酚、香豆素、木质素、黄酮等。肉桂精油(cinnamon essential oil，CEO)是从肉桂皮、肉桂叶等中提取出来的，为黄色油状、无毒且易挥发，研究表明CEO的主要成分肉桂醛具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等作用[5]。赵露露等[6]研究表明CEO对S.enterica具有良好的抗菌作用。吕飞等[7]研究表明CEO对腐败希瓦氏菌的细胞膜具有较强的破坏作用。同时王芳等[8]研究也发现CEO能够改变成团泛菌和腐生葡萄球菌细胞膜的通透性和完整性。然而目前有关CEO对S.enterica细胞膜损伤机制的研究鲜有报道。

因此，本实验以S.enterica为供试菌株，基于液体培养和平板培养体系，拟采用碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色和扫描电镜(scanning electron microscope，SEM)技术观察、结合一系列生理生化指标的测定，从细胞膜结构、膜通透性等方面探讨CEO对S.enterica细胞膜的影响，以期阐明CEO对S.enterica的抑菌机理，为开发安全、高效的S.enterica抑制剂提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试材料：肉桂，百味福食品有限公司。

供试菌株：沙门氏菌(Salmonellaenterica)，本实验室分离保存菌种。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理及CEO和肉桂醛提取

称取适量肉桂皮放入粉碎机粉碎，然后过40目筛，收集粉末备用。CEO提取参照徐红艳等[9]方法进行。肉桂醛提取参照姚杭村等[10]方法进行。

1.2.2 CEO成分分析

具体分析参照张凤兰等[11]方法进行。本实验通过GC-MS进行CEO的化学成分分析，具体条件和仪器设置参数如下：(1)气相色谱条件：色谱柱DB-17MS(30 m×250 mm，0.25 μm)；程序设置：初始温度为50 ℃，1 min，先升温至220 ℃(4 ℃/min)，保持8 min，继续升温至250 ℃(20 ℃/min)，保持2 min。进样温度为250 ℃，氦气载气，柱流量设置为1.0 mL/min，分流方式进样，分流比为250∶1；(2)质谱条件：进样方式为电子轰击(electron impact，EI)离子源，电子能量为70 eV，离子源温度为250 ℃，接口温度为230 ℃，相对分子质量扫描范围：15～500 u。

1.2.3 CEO抑菌活性的评价

1.2.3.1 菌悬液的制备

将S.enterica活化后，用无菌接种环挑取单个菌落接种于NB培养基中，37 ℃，150 r/min振动培养过夜，菌悬液浓度调整为1×106CFU/mL，备用[12]。

1.2.3.2 CEO和肉桂醛抑菌效果的测定

参照孙长花等[12]方法进行测定。利用牛津杯法测定CEO和肉桂醛对S.enterica的抑菌圈直径。吸取200 μL的菌悬液均匀涂布于NA培养基表面，然后垂直摆放4个无菌牛津杯，第一组加无菌水对照(CK)和CEO 100 μL；第二组加无菌水对照(CK)和肉桂醛单体55 μL；第三组加无菌水对照(CK)、CEO 100 μL和肉桂醛55 μL，经培养24 h观察菌体生长情况，然后用游标卡尺测量抑菌圈直径大小，观察并记录数据。

1.2.3.3 最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)和最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration，MBC)的测定

参照罗飞亚等[13]方法进行测定。将CEO用1%的吐温80水溶液稀释成13.8%(体积分数)的溶液。取9个无菌试管，标记为1～9号，1～8号为添加CEO组，9号试管作为对照组，1～8号试管中分别加入1 mL NB培养基，在1号试管中添加1 mL的CEO溶液摇匀后从1号试管取1 mL至2号试管，以此类推，从8号试管中取出1 mL弃去。然后在每支试管中添加1 mL菌悬液，使得CEO最终体积分数为0.012 5%、0.025%、0.05%、0.1%、0.2%、0.4%、0.8%和1.6%，充分混匀后分别从各试管内吸出100 μL均匀涂布在NA培养基上，在37 ℃恒温培养箱中培养12 h，观察并记录MIC。继续培养12 h，然后肉眼观察，记录MBC。生长菌体为阳性(+)，不生长菌体为阴性(-)，把不长菌的最小CEO浓度作为MIC和MBC，实验重复3次，结果取平均值。

1.2.3.4 生长曲线的测定

参照ZENG等[14]方法进行测定。向NB培养基中加入菌悬液使OD600nm=0.2。然后加入不同浓度(1/2 MIC、MIC)CEO。同时设置对照组。在37 ℃、150 r/min 的摇床中分别培养0、2、4、6、8、10、12 h时测定OD600nm值。以时间为横坐标，OD600nm值为纵坐标，绘制出CEO作用于S.enterica的生长曲线图，实验重复3次，结果取平均值。

1.2.3.5 残存菌数的测定

参照ZENGIN等[15]方法进行测定。本实验采用平板菌落计数法测定CEO对S.enterica的抗菌活性，将接种至NB培养基中的S.enterica于37 ℃下培养至对数生长期备用，使用PBS将菌液浓度稀释至1×106～107CFU/mL，然后加入不同浓度(1/2MBC、MBC)CEO，同时设置对照组，充分混匀后放置在37 ℃摇床中振荡培养，分别在0、2、4、6、8 h时吸取100 μL菌悬液涂布在NA培养基上，恒温培养24 h后对每个时段的残存菌数进行计数，实验重复3次，结果取平均值。

1.2.4 CEO对S.enterica细胞膜渗透性的影响

核酸泄漏量参照ZHANG等[16]方法测定。将过夜培养的S.enterica在5 000 r/min离心8 min，再悬浮在PBS中。在500 μL的PBS悬液中加入不同浓度(1/2 MIC、MIC)CEO，同时设置对照组。所有样品均在37 ℃下培养取上清液，测定OD260nm值，每2 h测定1次，持续8 h，实验重复3次，结果取平均值。

相对电导率参照蓝蔚青等[17]方法测定。过夜培养的菌液在5 000 r/min离心8 min。用5%葡萄糖洗涤沉淀作为等渗细菌溶液。然后，将不同浓度(1/2 MIC、MIC)CEO加入到5%的葡萄糖溶液中，使用电导率仪测量电导率记为L1。同时，在等渗细菌溶液中加入不同浓度(1/2 MIC、MIC)CEO，每隔2 h测定电导率记为L2，持续8 h。同时设置对照组，L0代表等渗S.enterica溶液在沸水中处理5 min后测得的电导率。实验重复3次，结果取平均值。采用公式(1)计算相对电导率：

(1)

1.2.5S.enterica细胞内超氧化物歧化酶(super oxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)活力以及丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量测定

SOD、CAT和MDA参照南京建成赛浩科技有限公司试剂盒方法进行测定。

1.2.6 CEO对S.enterica细胞膜完整性和微观结构的影响

细胞膜完整性采用PI染色检测，具体参照NOVO等[18]方法测定。在NB培养基中加入不同浓度(1/2 MIC、MIC、2 MIC)的CEO，同时设置对照组。过夜培养的S.enterica在5 000 r/min离心8 min，然后用PBS洗涤3次，重悬。将样品(包括5 μL PI染色液和95 μL菌液)置于37 ℃黑暗中染色30 min。离心弃上清液，然后PBS清洗3次，将染色好的菌液滴至载玻片上，用盖玻片覆盖，荧光显微镜观察拍照。

微观结构参照李云祥等[19]方法进行测定。挑取单个菌落在37 ℃，150 r/min的摇床中过夜培养。取2 mL菌悬液，加入不同浓度(1/2 MIC、MIC、2 MIC)CEO，并设置对照。37 ℃，150 r/min处理5 h，以5 000 r/min离心8 min，PBS洗涤3次，然后将S.enterica溶解在2.5%的戊二醛溶液中4 ℃下固定过夜，抽干固定剂，PBS清洗3次。然后使用不同体积分数(30%、50%、70%、80%、90%、95%)的乙醇对样品进行脱水15 min。最后，样品在乙酸异戊酯中置换30 min，最后将干燥后的菌体通过喷金处理后，使用SEM进行观察。

1.3 数据分析

所有数据均采用Microsoft Excel 2013进行数据处理；使用SPSS Statistics 25.0软件对数据进行显著性分析(P<0.05)；通过Origin 2018软件绘图。

2 结果与分析

2.1 CEO的化学成分

GC-MS分析表明CEO主要含38种化学成分(表1)，包括单萜烯类、倍半萜烯类及其含氧衍生物和少量的酯。其中反式肉桂醛相对含量较高，为55.00%，其余组分分别为(-)-α-荜澄茄油烯(13.28%)、δ-卡丁烯(9.39%)、α-衣兰油烯(5.22%)、γ-茂丁烯(2.11%)、小茴香酚(1.61%)和枯茗醛(1.24%)等，占总成分的87.85%。因此，CEO可能是通过多种化学成分的协同来发挥抗菌作用的。

表1 肉桂精油挥发性成分Table 1 Volatilecomponents of cinnamon essential oil

2.2 CEO和肉桂醛对S.enterica抑菌活性的研究

2.2.1 CEO和肉桂醛对S.enterica的抑菌效果

如图1所示，采用牛津杯法实验，从抑菌实验照片可以清晰看出，CEO和肉桂醛单体对S.enterica生长均具有明显的抑制作用，对照组对S.enterica没有抑菌作用，CEO的抑菌圈[(21.0±0.20) mm]更大，这说明除肉桂醛单体对S.enterica有抑制作用外，CEO的其他成分也有一定的抑制作用，但是作为CEO特征成分肉桂醛的贡献最大[(15.0±0.30)mm]。

a-CEO处理；b-肉桂醛处理；c-CEO和肉桂醛处理图1 CEO和肉桂醛对S.enterica抑菌效果Fig.1 Inhibitory effect of CEO and cinnamaldehyde on S.enterica

2.2.2 MIC、MBC的测定

采用二倍稀释法，分别进行涂布抑菌实验。通过平皿中菌落生长情况来判定MIC和MBC，如表2所示，当CEO体积分数≥0.1%时，均未见菌落生长，而当CEO体积分数≤0.05%时，平皿上出现菌落。由此得出CEO对S.enterica的MIC和MBC均为0.1%。表明CEO对S.enterica的抑菌效果良好。

表2 MIC值和MBC值Table 2 MIC and MBC values

2.2.3 生长曲线的测定

由于OD值与菌液浓度成正比，因此测定菌液OD值随时间变化的规律可以间接反应菌液浓度随时间变化的规律。如图2所示，对照组OD值2 h时开始升高，12 h时达到1.922，菌液浓度明显增加，表现为典型的“S”型，该时间段为菌群的对数生长期。在1/2 MIC处理组中，发现OD值略低于对照组，表明CEO处理有效延迟了菌群对数期的到来，但此过程在缓慢生长一段时间后，仍然会达到相应菌液浓度，然而在整个测定时间内MIC处理组的OD值未发生明显变化，说明该处理能够明显抑制S.enterica对数生长期的分裂和繁殖，使其无法达到正常的生长高峰。由此可知，CEO对S.enterica具有良好的抑制作用，并且随CEO浓度的增加而增强。

图2 CEO对S.enterica生长曲线的影响Fig.2 Effect of CEO on the growth curves of S.enterica

2.2.4 残存菌数的测定

图3 CEO作用于S.enterica不同时间点的残存菌数Fig.3 Time-dependent killing assay of CEO against S.enterica注：*表示差异显著(P<0.05)(下同)

2.3 CEO对S.enterica细胞膜通透性的影响

2.3.1 CEO对S.enterica核酸泄漏量的影响

细胞膜是细菌的第二道屏障，当细胞膜遭到破坏时，不仅会造成胞内小分子物质的泄漏，还会导致胞内DNA、RNA等大分子物质的泄漏。核酸大分子物质存在于细胞膜和细胞质之间，是菌体进行生理代谢必不可少的生物大分子。核酸在260 nm处具有最大紫外吸收值，并且吸光值与核酸浓度成正比[20]。因此，本研究通过测定260 nm处的光密度来分析细胞膜的受损程度，进而推测细胞膜的完整性。如图4所示，随着培养时间的延长，处理组的吸光值显著高于对照组(P<0.05)，其中1/2 MIC和MIC处理组在培养过程中吸光值均迅速上升，分别从0.042和0.041增加到0.145和0.336，而对照组则无明显变化。由此可见，CEO作用于S.enterica后，其细胞膜通透性发生了变化，核酸泄漏，影响了S.enterica的正常生长繁殖。因此CEO对S.enterica细胞膜具有一定的破坏作用，且破坏程度呈现CEO浓度依赖性，即浓度越高，破坏程度越大。

图4 CEO处理S.enterica核酸泄漏情况Fig.4 Release of nucleic acids from S.enterica following treatment with CEO

2.3.2 相对电导率的测定

细胞膜作为细菌细胞分泌、排泄、物质交换等生理功能的重要结构，其膜结构虽然较小，但其发生变化会使菌体保护屏障被打破，导致细胞膜通透性增加，细胞内小分子电解质泄漏出来，电导率上升，从而导致细胞代谢活动紊乱，引起菌体死亡[21]。本实验通过测定菌液相对电导率的变化来观察细胞膜通透性的变化情况。如图5所示，在整个培养时间内，处理组菌悬液的相对电导率显著高于对照组(P<0.05)。0 h时，处理组和对照组的相对电导率接近，这说明处理组培养液中的CEO和对照组中的去离子水相对电导率基本相近，因此可以排除由于液体成分的差异造成的影响；6 h时，1/2 MIC和MIC处理组菌悬液的相对电导率分别显著增加至34.97%和43.15%；继续培养至8 h时，其相对电导率基本不变，推测可能是由于CEO在培养前期发挥了较大作用，从而导致S.enterica细胞膜发生破裂。该结果与核酸泄漏量测定结果一致，因此可以推测，CEO破坏了S.enterica的细胞膜，导致细胞膜通透性增加，细胞内大量小分子物质泄漏，从而影响菌体细胞的正常代谢活动。

2.4 S.enterica细胞内SOD、CAT活性以及MDA含量测定

2.4.1S.enterica的SOD活性

SOD是菌体内重要的保护酶之一，对机体的氧化与抗氧化平衡具有重要作用，其可以清除超氧阴离子自由基(·O2-)，提高菌体对活性氧的耐受力，从而保护菌体细胞免遭损伤。因此，SOD活力的高低能够间接反映机体清除氧自由基的能力[22]。结果表明，S.enterica经不同浓度CEO处理2 h后，SOD活力均出现不同程度的下降，4 h时，SOD活力快速上升，且CEO浓度越高，上升幅度越大。其中，MIC处理组4 h时SOD活力达到最大，为149.16 U/mgprot；8 h时，SOD活力明显下降，且CEO浓度越高，SOD活力下降越显著(P<0.05)，而对照组则未发生明显变化(图6)。因此表明，CEO处理对S.enterica的SOD活力具有明显的影响，SOD活力降低，说明其对S.enterica自身的保护性下降，容易受到自由基的攻击而自溶。

图5 CEO对S.enterica细胞膜通透性的影响Fig.5 Effect of CEO on cell membrane permeability of S.enterica

图6 CEO处理对S.enterica菌体SOD活性影响Fig.6 Effect on the enzyme activity of SOD in S.enterica by CEO

2.4.2S.enterica的CAT活性

CAT是菌体内清除活性氧的重要保护酶之一，可使机体内H2O2发生歧化反应生成H2O和O2，从而使菌体细胞免遭H2O2的破坏[23]。如图7所示，S.enterica经不同浓度CEO处理4 h后，S.enterica的CAT活力呈现显著上升的趋势(P<0.05)，且均在4 h 时达到最大值，为87.37 U/mg prot和97.74 U/mg prot；8 h时，处理组CAT活力显著下降，且CEO浓度越高，下降越明显，而对照组无明显变化。以上结果表明，CEO逆境胁迫对S.enterica的CAT活性具有明显的影响。前期CAT活力提高是为保护菌体，但后期菌体衰老，代谢强度降低，CAT活性下降，清除H2O2和活性氧的能力减弱，蛋白质变性和膜脂过氧化程度严重。

改进阶段学生要进行桥模型稳定性及承重测试，小组成员探讨改善桥设计，建立新的模型并再测试，通过循环反复的测试、改进，提高学生的问题解决能力及交流合作能力，增强学习体验，培养批判能力和创新能力。

图7 CEO处理对S.enterica菌体CAT活力影响Fig.7 Effect on the enzyme activity of CAT in S.enterica by CEO

2.4.3S.enterica的MDA含量

MDA是膜脂过氧化作用的终极产物，可作为衡量机体脂质过氧化及细胞损伤程度的一个重要标志。机体产生的氧自由基不仅可以攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)引发细胞膜脂质过氧化反应，而且还能通过脂质过氧化物的分解产物(MDA)引起细胞损伤，进一步使细胞膜的脆性增加，流动性和通透性发生改变。本实验采用硫代巴比妥酸(thibabituric acid，TBA)显色法测定细胞内的MDA含量。如图8所示，不同浓度CEO处理2 h后，S.enterica的MDA含量均显著提高；4 h时MDA含量增速变缓，可能是由于前期CEO的加入导致自由基的积累，膜脂受到自由基的攻击，使得MDA含量增加，随着CEO诱导时间的延长，SOD活力增加，大量自由基被清除，因此MDA变化趋于平缓；8 h时，1/2 MIC和MIC处理组MDA含量均显著升高，分别为1.93、3.51 nmol/mg prot，且CEO浓度越大，MDA含量升高越显著(P<0.05)，对照组则始终趋于平稳状态，约为0.70 nmol/mg prot。这一结果表明CEO能够通过抑制S.enterica细胞内抗氧化酶的活性，提高MDA含量。

图8 CEO处理对S.enterica菌体MDA含量的影响Fig.8 Effect on the concent of MDA in S.enterica by CEO

2.5 CEO对S.enterica细胞膜完整性和微观结构的影响分析

2.5.1 PI检测CEO对S.enterica细胞膜完整性的影响

基于前面的研究发现，CEO能够导致S.enterica细胞膜通透性改变，因此通过PI染色技术进一步观察其对S.enterica细胞膜完整性的影响。PI是一种核酸荧光探针，它只能穿透受损的细胞膜与DNA结合呈红色。正常情况下，菌体的细胞膜结构完整，PI染料无法对菌核进行染色，在荧光显微镜下观察不到荧光。而当细胞膜发生破损时，很多原本不能透过细胞膜的物质便可自由穿过，PI进入细胞和DNA发生结合，同时，通过特定激发波长即可在荧光显微镜下观察到红色荧光[24]。因此，检测PI对细胞的染色情况可以间接反映CEO对细胞膜完整性的影响。如图9所示，对照组几乎未观察到红色荧光，表明无明显坏死的S.enterica细胞；1/2 MIC处理组出现少部分红色荧光，MIC处理组出现大部分红色荧光，2 MIC处理后出现大面积红色荧光，因此表明，CEO处理后S.enterica细胞膜完整性遭到破坏，且CEO浓度越高，完整性破坏作用越明显。

a-对照；b-1/2 MIC；c-MIC；d-2MIC图9 荧光显微镜观察CEO作用S.enterica细胞Fig.9 S.enterica treated with CEO were observed by fluorescence microscope

2.5.2 CEO对S.enterica微观结构的影响

采用SEM技术可以较为直观地反映出CEO处理前后菌体形态结构的变化，以此判断S.enterica的受损情况。如图10所示，对照组细胞表面较为光滑平整，外观饱满，无缺损，且呈典型的杆状结构，表明菌体结构完整，生长状态良好。而经CEO处理4 h后，菌体经历了明显的形态变化，细胞呈现不同程度的皱缩、破裂，且细胞间界限模糊。其中MIC处理组菌体表面粗糙、形状扭曲，而2 MIC处理组在形状扭曲的基础上，部分细胞还相互黏结，形态破坏更为明显。结果表明CEO会破坏S.enterica的细胞结构，该结果与CEO对细胞膜通透性实验结果一致。

a-对照；b-1/2MIC；c-MIC；d-2MIC图10 CEO对S.enterica形态结构的影响Fig.10 Effect of CEO on morphological structure of the S.enterica

3 讨论

本实验通过对S.enterica微观结构以及细胞膜通透性等方面的研究，初步探讨了CEO对S.enterica的抑菌机制。通过GC-MS分析得到CEO的主要成分为反式肉桂醛。抑菌实验表明，CEO对S.enterica具有明显的抑制作用且存在明显的浓度依赖性，同时通过SEM观察发现CEO能够破坏S.enterica的细胞结构，引起细胞受损，使得菌体无法快速恢复，从而使胞内物质发生泄漏，导致菌体形态发生明显改变，这可能是CEO抑制S.enterica菌体生长的主要原因[25]。这与王芳等[8]发现CEO对成团泛菌和腐生葡萄球菌生长具有抑制作用的结果一致。

在研究CEO对S.enterica的抗菌机理时，首先考虑的是CEO如何突破S.enterica细胞膜的防御体系。本研究结果表明CEO处理改变了S.enterica细胞膜的通透性，从而使得核酸和小分子电解质不断从胞内外泄。MIC处理组中，S.enterica的细胞膜遭到破坏，通透性增大，小分子物质和核酸的泄漏量增多，与对照组相比差异显著(P<0.05)，该现象说明CEO可作用在细胞内部，打破正常生理活动，从而使S.enterica生长受到抑制。本结果与侯伟峰等[26]的实验结果一致，可以推测CEO的作用靶点是菌体细胞膜，使细胞不能维持正常的生理代谢活动，从而引起S.enterica死亡。

4 结论

综合微观结构、细胞膜通透性等方面的研究，推测CEO对S.enterica的抑菌机理是通过诱导活性氧在胞内的积累，引起氧化胁迫反应，从而导致细胞膜的完整性丧失，最终使菌体生长受到抑制。