不同分子质量阿胶组分对RAW264.7小鼠巨噬细胞的免疫调节作用

张国伟，马俊华，梁玉景，王召君，曾茂茂，陈洁，秦昉，何志勇*

1(食品科学与技术国家重点实验室(江南大学)，江苏 无锡，214122)2(山东华信制药集团股份有限公司，山东 菏泽，274000)

免疫系统是一种宿主防御系统，其作用是清除病原体。免疫系统分为固有免疫和获得性免疫系统。固有免疫通过皮肤、黏膜组织、骨髓或炎症成分(细胞因子、干扰素等)筑人体抵抗病原体入侵的第一道防线[1]。巨噬细胞在固有免疫中发挥着重要作用，它可以吞噬和消化病原微生物，介导和促进炎症，以及加工和呈递抗原[2]。活化的巨噬细胞可以释放多种炎症因子和细胞因子，调节适应性免疫反应[2]，从而抵御病原体入侵，保护机体免受侵害，因此巨噬细胞的激活是机体提高免疫力、保护自身健康的重要途径。

阿胶是一种重要的药食同源资源，在我国的生产历史悠久，药用历史已有2 000多年。阿胶的主要成分为蛋白质、脂质、糖类和微量元素，其中，蛋白质含量高达70%以上[3]。相关研究表明，阿胶具有一系列的药理学功能，有免疫调控、补血升白、抗氧化、抗衰老等功效。在免疫调控方面，有研究表明，阿胶可以改善免疫缺陷小鼠的固有免疫和适应性免疫[4]，也有学者研究了阿胶对于5-氟尿嘧啶诱导的贫血小鼠免疫的调控作用，发现阿胶可以增加外周白细胞和红细胞数量，对小鼠免疫细胞具有保护作用[5]。

阿胶主要由驴皮经熬煮、浓缩制作而成，在驴皮的化胶过程中，其主要成分胶原蛋白会发生聚集和降解而形成不同分子质量分布的阿胶蛋白组分，其分子质量大多在10 kDa以上。胶原蛋白聚集和降解程度与驴皮熬煮加工温度和时间等条件密切相关[6]，并且阿胶制作过程中胶原蛋白也会和糖类发生美拉德反应。然而，阿胶中蛋白组分免疫活性与其分子质量的关系并不明确，通过明确阿胶中强免疫活性的蛋白分子质量组成，可以调控阿胶熬煮加工过程的条件，制造出免疫调节功能强的阿胶产品，对于优质阿胶的生产加工具有重要意义。因此，本文以RAW264.7小鼠巨噬细胞系为模型，研究阿胶不同分子质量组分对RAW264.7 细胞的活化作用，进一步探究免疫活性强的蛋白组分对RAW264.7细胞活化的机制，从而评价阿胶的免疫调节作用，以期为高免疫活性阿胶产品的加工制造提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

阿胶，山东华信制药集团提供；RAW264.7细胞，中国科学院细胞库；DMEM高糖细胞培养液，美国Gibco；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)，长沙赛尔博克斯生物科技有限公司；白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测试剂盒、Western blot试剂盒，武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；Trizol试剂盒、MTT试剂盒、NO检测试剂盒和活性氧荧光探针(2′, 7′-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA)，上海碧云天生物技术有限公司；GAPDH内参引物、逆转录试剂盒、PCR引物，上海生工生物工程；HRP标记兔抗小鼠一抗、HRP 标记山羊抗兔二抗，美国Cell signal technology；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 阿胶不同分子质量组分的制备及其蛋白质含量和分子质量分布测定

脱脂：配制质量浓度为50 g/L的阿胶溶液，使用2倍体积的石油醚于分液漏斗内进行脱脂，重复3次，脱脂后，8 000 r/min离心10 min，取上清液，获得阿胶脱脂液。分级：配制20 g/L的牛血清白蛋白、鸡卵白蛋白、碳酸酐酶、肌红蛋白、抑肽酶溶液，用Superdex 75pg 进行分子质量标准曲线测定，以出峰时间为x轴，分子质量的对数值为y轴，测定分子质量出峰时间标准曲线，然后根据标准将阿胶脱脂液使用50 mmol/L pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液于AKTA pure蛋白质纯化系统进行分级，分离获得<10 kDa、10～30 kDa、>30 kDa 3种不同分子质量的阿胶组分溶液。透析：将获得的不同分子质量的阿胶脱脂液分装于透析袋(1 kDa)中，超纯水4 ℃透析48 h，冷冻干燥后备用，分别命名为F1、F2、F3。

蛋白质含量测定：采用双缩脲法[7]测定样品蛋白质含量。称取6 g酒石酸钠，1 g碘化钾，1.5 g硫酸铜，依次搅拌溶入约500 mL水中，然后和300 mL 10%的氢氧化钠混合，最后用水稀释定容到1 000 mL得到双缩脲试剂，1 mL样品溶液与4 mL双缩脲试剂混合后在30 ℃水浴20 min后，测定其在540 nm处的吸光值，以牛血清白蛋白为标准物测定标准曲线。

采用HPLC测定分子质量分布[8]：流动相，PBS缓冲液(0.2 mol/L，pH=7.0，0.3 mol/L NaCl)；进样体积10 μL；运行时间10 min；检测波长220 nm。以杆菌肽、抑肽酶、细胞色素C、肌红蛋白、甲状腺球蛋白为标准物质测定以出峰时间为x值，分子质量的对数为y值的标注曲线。

1.2.2 RAW264.7细胞培养

将原代RAW264.7加入DMEM 高糖完全培养基(含5% FBS)中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，当细胞铺满培养瓶底部80%时进行传代，当培养至第3代细胞稳定生长时，将培养至对数生长期的细胞用于后续实验。

1.2.3 阿胶分离组分F1、F2、F3对RAW264.7细胞活性及刺激细胞释放NO及TNF-α的含量

细胞活性的测定参照文献[9]方法，取对数生长期的RAW264.7细胞，以2×104个/孔(96孔板)的密度铺板，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h后，PBS洗去未贴壁细胞，然后1 000 mg/L的阿胶分离组分的DMEM完全培养基继续置于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育24 h后，吸去培养液，加入10 μL MTT溶液和90 μL DMEM培养液，继续孵育4 h后，吸去培养液，加入150 μL 二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，振荡10 min后，使用酶标仪检测在490 nm处的吸光值。以10 μg/mL脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)处理的细胞作为阳性对照。细胞活力计算如公式(1)所示：

(1)

参照文献[10]方法，取对数生长期的RAW264.7细胞，以2×104个/孔(96孔板)的密度铺板，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h后，PBS洗去未贴壁细胞，然后含有一系列质量浓度(1 000、500、250、125、62.5 mg/L)阿胶分离组分的DMEM完全培养基继续置于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育24 h，取细胞培养上清液，根据试剂盒说明书采用Griess法测定NO浓度，细胞培养液中的TNF-α含量根据ELISA试剂盒说明书测定。

1.2.4 阿胶分离组分F2对RAW264.7细胞的免疫增强作用

1.2.4.1 MTT法检测细胞活性

参照1.2.3中的方法测定1 000、500、250、125、62.5 mg/L的F2组分对RAW264.7巨噬细胞活性的影响。

1.2.4.2 活性氧(reactive oxygen species,ROS)和IL-6释放量的测定

ROS的测定方法[11]：取对数生长期的RAW264.7细胞，以2×105个/孔(12孔板)的密度铺板，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h后，PBS洗去未贴壁细胞，以不同浓度的F2处理细胞24 h，吸去上清液，加入1 mL PBS，收集细胞，使用荧光分光光度计在激发波长和发射波长分别在488 nm和525 nm处测定荧光值。以10 mg/L LPS处理的细胞作为阳性对照。ROS释放量计算如公式(2)所示：

(2)

IL-6的测定方法参见1.2.3中TNF-α含量测定。

1.2.5 实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，q-PCR)检测免疫相关基因的表达情况

参照文献[9]方法进行实验。取对数生长期的RAW264.7细胞，以2×105个/孔(12孔板)的密度铺板，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h后，PBS洗去未贴壁细胞，以不同浓度的F2处理细胞24 h，吸去上清液，冰浴，加入1 mL Trizol试剂，裂解细胞，根据试剂盒说明书提取细胞mRNA，然后使用反转录试剂盒完成反转录，得到cDNA。引物合成由上海生工生物工程公司完成，引物序列如表1所示，q-PCR反应体系及条件均按照试剂盒说明书条件进行操作，测定TNF-α、IL-6、诱导型一氧化氮合酶( inducible nitric oxide synthase ，iNOS)、Toll样受体 4(Toll-like receptor 4,TLR4)和内参GAPDH的基因转录情况。

表1 q-PCR目的基因引物序列Table 1 The primer sequence of q-PCR target gene

1.2.6 阿胶分离组分F2对RAW264.7细胞内MAPK信号通路的影响

参照文献[9]方法进行实验。取对数生长期的RAW264.7细胞，以2×105个/孔(12孔板)的密度铺板，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h后，PBS洗去未贴壁细胞，以1 000 mg/L的F2处理细胞4、8、16 h后，收集细胞，按照试剂盒说明说提取细胞蛋白质。采用Western-blot方法检测丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路相关蛋白的表达情况。

1.2.7 统计学分析

所有实验数据采用Statistix 9软件进行统计学分析，结果均以平均值±标准差的形式(SD)表示，每个实验重复3次。数据的显著性采用t检验进行比较。当P<0.05，则差异显著。

2 结果与分析

2.1 阿胶不同分子质量组分的蛋白质含量及分子质量分布

经测定，分离制得的F1、F2、F3组分的蛋白质含量分别为(91.88±0.37)%、(94.34±1.72)%和(94.75±0.80)%。其分子质量分布色谱图如图1所示，kw 804凝胶色谱柱的标准曲线为(R2=0.995 0)，组分F1中，Mw<10 kDa占比81.91%，组分F2中，Mw在10～30 kDa占比85.85%，组分F3中，Mw>30 kDa占比89.83%。

图1 F1、F2和F3分子质量分布液相色谱图Fig.1 Liquid chromatogram of the F1, F2 and F3’s molecular weight distribution

2.2 阿胶分离组分F1、F2、F3对RAW264.7细胞细胞活性及刺激细胞释放NO及TNF-α的含量

NO是一种神经传递调节剂，可作为血管舒张剂并保护机体免受病原体侵害。NO与巨噬细胞的抗病毒功能、炎症反应、免疫反应等功能密切相关[12]，TNF-α可以激活线粒体产生ROS，并通过NF-κB调节蛋白调节IL-6、IL-8和NO的释放[13]。因此，通过比较阿胶分离组分处理细胞后NO和TNF-α的释放量，可以大致明确不同阿胶分离组分的免疫活性强弱。如图2所示，与空白对照组相比，所有的阿胶分离组分处理细胞后，对细胞活性均无显著性影响，NO和TNF-α释放量明显增加，其中，1 000 mg/L F2处理细胞后上清液中NO和TNF-α的含量分别为38.87 μmol/L和6 577.29 μg/L，比F1处理后的细胞分别高297.85%和962.86%，比F3处理后的细胞分别高38.87%和15.25%，具有显著差异(P<0.05)，与LPS处理细胞组相比，释放量稍低。说明阿胶中免疫活性最强的组分为10～30 kDa的蛋白组分，因此，后续以F2为研究对象，探讨其免疫增强作用和机制。有学者对鲤鱼卵蛋白进行了酶解，并通过体内实验验证了酶解后蛋白的免疫增强活性，结果表明酶解后蛋白的分子质量大都在5～90 kDa，具有良好的免疫增强活性[14]。

2.3 阿胶分离组分F2对RAW264.7细胞的免疫增强作用

2.3.1 F2对RAW264.7细胞活性的影响

F2对RAW264.7细胞的毒性作用如图3-a所示，与空白对照组相比，不同浓度的F2对RAW264.7细胞的活力没有影响，表明F2为62.5～1 000 mg/L时，对RAW264.7巨噬细胞无毒性作用。因此，选择62.5、125、250、500、1 000 mg/L 5个质量浓度梯度进行后续实验。

a-细胞活性；b-NO；c-TNF-α图2 不同浓度F1、F2和F3对RAW264.7细胞细胞活性、NO和TNF-α释放量的影响Fig.2 The effects of Cell viability, the production of NO and TNF-α of RAW264.7 cells treated with F1, F2 and F3 at different concentration注:不同字母表示具有显著性差异(P<0.05)(下同)

2.3.2 F2对RAW264.7细胞释放ROS和IL-6的影响

IL-6可以通过MAPK信号通路影响免疫和生理过程，如细胞增殖和分化的增加、抗体合成的增强以及急性蛋白的产生[15]。不同浓度的F2对RAW264.7细胞释放ROS和IL-6的影响如图3-b和图3-c所示，当F2质量浓度为500 mg/L时，细胞释放的ROS与空白对照有显著差异(P<0.05)，在1 000 mg/L时，ROS释放量比空白对照高31.58%，但比LPS处理组低。当F2的质量浓度为62.5 mg/L时，IL-6的分泌量与空白对照组相比有显著差异(P<0.05)，当质量浓度增加到1 000 mg/L时，IL-6分泌量与阳性对照LPS无显著性差异(P>0.05)。结果表明，ROS和IL-6的释放量随F2浓度的升高而升高，具有明显的剂量依赖性。

综合所述，F2能够提升RAW264.7细胞NO、ROS以及TNF-α和IL-6等细胞因子的释放量，从而促进巨噬细胞发挥免疫功能。YANG等[12]研究了太子参蛋白水解物的免疫增强活性，也能通过促进RAW264.7巨噬细胞分泌NO和TNF-α从而活化巨噬细胞。柚皮蛋白也可以通过促进巨噬细胞分泌NO、TNF-α和IL-6从而发挥其免疫增强活性[16]。

a-细胞活力；b-ROS；c-IL-6图3 不同浓度的F2处理后，RAW264.7细胞活力、ROS和IL-6释放量的影响Fig.3 The effects of cell viability the production of ROS and IL-6 of RAW264.7 cells treated with different concentrations of F2

2.4 F2对免疫相关基因的表达情况的影响

用q-PCR检测细胞中mRNA的含量，结果如图4-a 所示。100 mg/L的F2能显著促进TNF-α基因的表达(P<0.05)，并且，随着F2浓度的升高，基因的表达量也随之升高，与经F2刺激后，细胞释放的TNF-α蛋白趋势相同。IL-6基因的表达量如图4-b所示，100 mg/L的F2能使得细胞中IL-6 mRNA的量相比空白对照组高4.5倍，但无显著性差异(P>0.05)，100 mg/L的F2能极显著(P<0.01)促进IL-6基因的表达。iNOS是巨噬细胞受到刺激后，在细胞内合成并发挥作用，在NO的合成中发挥重要的作用，参与NO诱导的肿瘤细胞毒性[10]，在F2的刺激下，细胞iNOS基因的表达量也显著上升，具有促进NO合成的作用。 TLR4是巨噬细胞表面参与固有免疫应答的一种重要模式识别受体，相关研究表明，TLR4对物质的识别是激活MAPK信号通路的重要介质[17]。因此检测TLR4基因的表达量能检测F2组分是否能与细胞表面的TLR4结合，从而调控细胞内的生理活动，如图4-d所示，100 mg/L的F2就能显著促进TLR4基因的表达(P<0.05)，当F2质量浓度达1 000 mg/L时，TLR4 mRNA含量最高，为空白对照组的1.72倍，由此推测，F2可以和巨噬细胞表面的TLR4结合，从而调控细胞的生理活动。CHANG等[18]研究了茯苓蛋白对巨噬细胞的活化作用后发现，茯苓蛋白通过与巨噬细胞表面的TLR4结合，进而发挥其免疫增强活性。武文佳[19]研究了小麦胚芽球蛋白碱性酶水解物的免疫增强活性，通过TLR4抗体预处理细胞发现，NO、ROS、TNF-α和IL-6的分泌量降低，证实了其可以和巨噬细胞表面的TLR4结合，从而调控细胞内的生理活动。

a-TNF-α；b-IL-6；c-iNOS；d-TLR4图4 F2对免疫相关基因的表达情况的影响Fig.4 The effects of F2 on the mRNA expression levels of TNF-α, IL-6, iNOS, and TLR4 in RAW264.7 cells

2.5 F2对RAW264.7细胞内MAPK信号通路的影响

MAPK是丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶家族，细胞受到刺激后，它可以参与巨噬细胞NF-κB活化的启动[20]。已有研究表明，在哺乳动物细胞中有3种具有代表性的MAPK途径：细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)1/2、C-Jun氨基末端蛋白激酶(C-Jun N-terminal protein kainse,JNK)和P38[20]。为了研究F2发挥其免疫增强活性的机理，使用Western blot分析检测ERK、JNK和p38 MAPK通路的磷酸化水平。采用1 000 mg/L的F2处理细胞4、8、16 h，探究随着时间的变化MAPK信号通路激活的情况，结果如图5所示，1 000 μg/mL的F2可以增加JNK、ERK和P38的磷酸化，JNK蛋白的磷酸化在16 h时程度最大，为对照组的7倍，ERK和P38蛋白的磷酸化在8 h时程度最大，分别为对照组的2.5和1.5倍。说明F2可以通过提高JNK、ERK和P38蛋白的磷酸化程度来活化巨噬细胞，从而发挥其免疫调节作用。

越来越多的研究表明，食品中的蛋白质类物质具有增强免疫作用[16,21]，但是由于蛋白质的分子质量较大，直接进入细胞内发挥其生物学功能很困难，一般会在细胞表面与细胞表面的模式识别受体相结合，进而调控细胞内的生物学活动，发挥其免疫增强功能。本研究纯化获得的分子质量在10～30 kDa的阿胶组分，可以和巨噬细胞表面的TLR4结合，从而激活细胞内的MAPK信号通路，增加JNK、ERK和P38蛋白的磷酸化水平，从而调控细胞内的基因表达水平，增加相关基因转录mRNA，促进巨噬细胞分泌更多的NO、ROS、TNF-α和IL-6，从而使得巨噬细胞活化。

a-Western-blot图；b-相对JNK表达量；c-相对ERK表达量；d-相对P38表达量图5 Western-blot检测1 000 μg/mL的F2处理RAW264.7细胞4、8、16 h后MAPK信号通路相关蛋白的表达情况及其蛋白表达量的相对灰度分析图Fig.5 Western-blot detection of the expression of MAPK signaling pathway-related proteins in RAW264.7 cells treated with 1 000 μg/mL F2 for 4, 8 and 16 h and their relative grayscale analysis

3 结论

本研究用Superdex 75pg葡聚糖凝胶柱将阿胶分为了分子质量不同的3个组分(F1，<10 kDa；F2，10～30 kDa；F3，>30 kDa)，通过比较不同组分刺激巨噬细胞NO和TNF-α的分泌量，明确了阿胶中具有最强免疫功能的组分为分子质量在10～30 kDa的F2组分。进一步通过q-PCR和Western-blot方法明确了F2组分对RAW264.7巨噬细胞的活化作用及其作用机制，即F2组分可以促进RAW264.7细胞分泌NO、ROS、TNF-α和IL-6，分泌量具有显著的剂量依赖性。并且刺激巨噬细胞相关基因的表达，增加MAPK信号通路中JNK、ERK和P38蛋白的磷酸化，激活MAPK信号通路，揭示其免疫增强活性与MAPK信号通路有关。该研究结果将为优化阿胶的生产加工条件以生产高质量阿胶产品提供很好的理论依据和指导，具有重要的实际意义。