黄曲霉毒素B1降解菌的筛选及生物学特性分析

张瑾，余祖华，丁轲，李旺，李元晓，曹平华，贾艳艳，何万领，赵龙妹，廖成水

1(洛阳市活载体生物材料与动物疫病防控重点实验室，河南 洛阳，471023)2(功能微生物与精准营养重点实验室，河南 洛阳，471023)

黄曲霉毒素是主要由黄曲霉(Aspergillusflavus)和寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)等合成的次级代谢物[1-2]，其化学成分是二氢呋喃香豆素的衍生物。黄曲霉毒素B1(aflatoxin, AFB1)、AFB2、AFG1和AFG2是4种主要的黄曲霉毒素，而因其具有肝毒性、致癌性、致畸性和免疫抑制等特点被列为一级致癌物[3-4]。

小麦、玉米和大豆等饲料原料和食品中普遍存在AFB1，严重影响了人畜安全。目前已经提出了物理法、化学法和生物法来降解AFB1[5-7]，而由于物理法和化学法存在成本高、化学残留、食品营养成分被破坏等限制，这些方法均不太理想[8]。而AFB1的生物降解法因具有对毒素高度专一性、无污染、不破坏食品营养等优点，近年来已成为国内外AFB1脱毒的研究热点[9]。雷元培等[10]筛选降解AFB1菌霉立解060菌，经鉴定为枯草芽孢杆菌，其对AFB1、AFG1和AFM1的降解率分别为73%、71%和59%。AMRA等[11]研究表明小鼠连续7 d口服1×1010CFU/mL鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)可显著降低AFB1引起的毒性。SHU等[12]以香豆素为唯一碳源的培养基分离出AFB1降解菌枯草芽孢杆菌DY3108，该菌在较宽的pH和温度下都有降解效果。SONG等[13]对铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)M19对AFB1的生物降解进行了评价，从该菌中分离纯化了AFB1降解酶(AFB1-degrading enzymes，PADE)，PADE在65 ℃、pH 6.0时对AFB1的降解活性最高。ADEBO等[14]发现乳酸菌可以通过吸附作用与AFB1结合，培养48 h后可以清除54%的AFB1。虽然关于生物降解方面的研究较多，但大多研究停留在菌株的筛选与鉴定，未对菌株生长条件和益生性深入研究。因此，开发微生物降解AFB1具有非常重要的意义。本研究旨在筛选到1株降解AFB1的益生菌，采用形态观察、生理生化试验和分子生物学方法对菌株进行鉴定，并对菌株生物学特性进行初步研究，为进一步开发微生物降解AFB1提供基础材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验样品

发霉花生、玉米、青贮饲料等采集自洛阳某地。

1.1.2 培养基与试剂

香豆素初筛液体培养基(g/L)：KH2PO40.25、MgSO4·7H2O 0.25 、KNO30.5、(NH4)2SO40.5、CaCl20.005、FeCl3·6H2O 0.003、香豆素1.0，pH 7.0，121 ℃高压灭菌30 min。

香豆素初筛固体培养基：香豆素初筛液体培养基加入1.5%(质量分数)琼脂配成香豆素初筛平板培养基，121 ℃高压灭菌30 min。

LB培养基(g/100mL)：胰蛋白胨1.0，NaCl 1.0，酵母抽取物0.5，pH 7.0，121 ℃高压灭菌30 min。

试剂：AFB1标准品，上海酶联生物科技有限公司；AFB1ELISA检测试剂盒，北京华安麦科生物公司；DNA Marker、通用引物，南京擎科生物股份有限公司；DNA 提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司；Pepsin、Trypsin、牛胆盐，天津市博迪化工有限公司。

1.1.3 仪器与设备

Thermo Muultiskan-FC型酶标仪，美国Thermo Fisher scientific公司；9700T 型PCR仪，西安天隆科技有限公司；OE UV1200 型紫外可见分光光度计，翱艺仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 降解AFB1菌株的筛选

按照AIGAMMAI等[15]的方法进行初筛，具体为：分别取5 g不同样本置于100 mL无菌水中，在涡旋振荡器上振荡10 min，静置20 min后取上层悬浊液100 μL，用无菌水将其梯度稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，以2%接种量分别将悬浊液接种于含有香豆素的初筛液体培养基，37 ℃、200 r/min摇床培养。24 h后吸取菌液100 μL涂布于香豆素初筛平板，37 ℃培养24 h后选取生长良好的单菌株，连续3次划线于香豆素初筛平板，待长出单菌落后进行纯化并保存菌株。

1.2.2 菌株的复筛

取上述纯化的菌株，分别按2%接种于含0.5 μg/mL AFB1的LB培养基，以未接菌的含0.5 μg/mL AFB1的LB培养基做对照组，每株菌做3个重复，37 ℃振荡培养48 h后取样，按照AFB1ELISA检测试剂盒说明书检测AFB1的残余量。AFB1降解率的计算如公式(1)所示：

(1)

式中：W0，对照组AFB1含量；W1，处理组AFB1含量。

选择降解率最高的菌株进行鉴定与生物学特性测定。

1.2.3 菌株的形态学鉴定

将菌株在LB培养基上纯化划线培养，使其长出单个菌落，观察其形态大小，并挑取少许菌落进行革兰氏染色镜检。

1.2.4 菌株的生理生化鉴定

菌株的生理生化特征依据《伯杰细菌鉴定手册》[16]进行鉴定。

1.2.5 菌株的16S rRNA鉴定

利用细菌基因组DNA快速提取试剂盒提取分离菌株ZJ20的全基因组，以DNA为模板用细菌16S rRNA 通用引物(上游引物27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)进行PCR反应。PCR反应体系为:PremixTaq12.5 μL，模板1 μL，上游引物、下游引物各1 μL，加ddH2O至25 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min；95 ℃变性40 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34个循环；72 ℃再延伸7 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶检测，然后通过凝胶成像系统检测观察结果。

1.2.6 基于16S rRNA序列系统进化树分析

将PCR产物送至上海生物工程有限公司测序。将拼接后的序列在NCBI网站(美国国立生物技术中心网站)进行BLAST比对分析，将目标序列与同源性较高的序列运用MEGA 7.0软件包中的Kimura2-parameter法计算遗传距离，运用邻接法(neighbor joining,NJ)法构建系统进化树。

1.2.7 菌株的生物学特性

1.2.7.1 菌株生长曲线测定

将活化的降解菌株按2%接种量接入LB培养基，混匀后立即测定OD600值，37 ℃培养20 h，期间每隔2 h测定OD600值，以时间为横坐标，OD600值为纵坐标绘图得到生长曲线。

1.2.7.2 菌株酸耐受性试验

将活化的菌液在4 000 r/min下离心10 min，弃上清液，将菌体重悬于等体积的pH值为3.0、4.0、5.0 的无菌生理盐水中，以pH值7.0为对照，振荡器混匀后，37 ℃孵育3 h，在0、1、2、3 h取100 μL菌液于900 μL无菌水中，依次倍比稀释至 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8，选择适宜梯度菌液100 μL涂布于LB琼脂平板，每个稀释度做3个重复，24 h后选取菌落数在30～300的计数。每毫升菌落数计算如公式(2)所示：

(2)

式中：C,合适稀释浓度下的平均菌落数；V,涂布平板所用稀释液的体积，mL；M,稀释倍数。

1.2.7.3 菌株胆盐耐受性试验

将活化的菌液在4 000 r/min下离心10 min，在100 mL的LB液体培养基中分别加入0.1、0.2、0.3 g的牛胆盐，制成1、2、3 g/L牛胆盐的LB液体培养基，37 ℃恒温培养3 h，按照1.2.7.1方法进行活菌计数。

1.2.7.4 菌株人工胃肠液耐受性试验

胃蛋白酶(pepsin)0.3%、NaCl 0.2%、蛋白胨0.12%、酵母膏0.31%(均为质量分数)，调至pH 2.0，经 0.22 μm滤菌膜过滤除菌制成人工胃液。胰蛋白酶(trypsin)0.1%、NaHCO31.1%、NaCl 0.2%、牛胆盐1.2%(均为质量分数)，调至pH值为8.0，过滤除菌制成人工肠液。将活化的菌液在4 ℃、4 000 r/min下离心10 min，弃上清液，取菌体悬浮于人工胃肠液中，37 ℃孵育，分别于0、3 h进行活菌计数。

1.2.7.5 菌株抑菌试验

分别取大肠杆菌CVCC1527、金黄色葡萄球菌ATCC6538、鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028接种到营养肉汤培养基中，37 ℃培养24 h，调节菌悬液的浓度为1.0×108CFU/mL。取100 μL涂布到LB固体培养基，将已灭菌的牛津杯等距放置在平板上，牛津杯中加入菌株ZJ20上清液100 μL，37 ℃培养12 h，测量抑菌圈直径的大小来判断受试菌对指示菌的抗菌能力。

1.2.8 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 降解AFB1菌株的初分离

样品中的菌株在香豆素初筛培养基富集后，以AFB1为唯一碳源的基础培养基上进行分离，根据菌落形态不同，初步分离42株对AFB1可能具有降解功能的菌株。

2.2 不同菌株对AFB1降解率测定结果

初筛的菌株虽对AFB1均有降解能力，但不同样品来源的菌株的降解率不同，其中对 AFB1降解率>30%的菌株有12株(表1)，降解率>50%的菌株有6株，菌株ZJ20对AFB1的降解率最高，可达84.23%，因此选择ZJ20做进一步研究。

表1 部分分离菌株对AFB1的降解率Table 1 Degradation rates of AFB1 by isolated strains

2.3 菌株ZJ20形态学鉴定结果

菌株ZJ20菌落形态：白色、不透明、中间凸起、有褶皱、边缘不整齐；显微形态：革兰氏阳性菌、菌体呈杆状、中生芽孢(图1)。

a-菌落形态；b-显微形态图1 菌株ZJ20的菌落形态及显微形态(1 000×)Fig.1 Colony morphology and microscopic morphology (1 000×) of ZJ20

2.4 菌株ZJ20生理生化鉴定结果

菌株ZJ20生理生化实验结果见表2，该菌株VP试验、明胶液化试验阳性；硫化氢试验、吲哚试验、硝酸盐试验阴性；能够发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖，不用利用乳糖、甘露糖等。对照《伯杰细菌鉴定手册》，初步判定ZJ20为枯草芽孢杆菌。

表2 菌株ZJ20的生理生化鉴定结果Table 2 Biochemical identification results of strain ZJ20

2.5 菌株ZJ20的16S rRNA鉴定结果

以菌株ZJ20基因组DNA为模板，经PCR扩增产物电泳，在约1 500 bp处有1条特异性条带，与预期大小相符，见图2。测序结果显示该菌株的16S rRNA 序列长度为1 454 bp，将序列提交GenBank获得登录号为SUB10217538。

M-Marker 2 000；1-阴性对照；2-PCR产物图2 菌株ZJ20的16S rRNA片段PCR扩增结果Fig.2 PCR amplification results of 16S rRNA fragment of strain ZJ20

2.6 基于16S rRNA序列系统进化树分析结果

将测序结果与NCBI中已有的16S rRNA序列进行BLAST比对，通过MEGA7.0软件中的“Neighbor-Joining(NJ)”模块对该序列进行系统进化树分析。由图3可知，菌株ZJ20与BacillussubtilisYEBN5 MT372156.1在进化树上处于同一个分支，亲缘关系最近，因此，可鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，命名为BacillussubtilisZJ20。

图3 基于16S rRNA序列的菌株Bacillus subtilis ZJ20系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of Bacillus subtilis ZJ20 based on 16S rRNA sequence

2.7 菌株Bacillus subtilis ZJ20生物学特性

2.7.1 菌株BacillussubtilisZJ20生长曲线

由图4可知，BacillussubtilisZJ20生长曲线呈现迟缓期、对数期和稳定期。0～ 4 h是该菌的迟缓期，4～8 h 进入对数生长期，8 h后进入细菌生长稳定期。

图4 Bacillus subtilis ZJ20生长曲线Fig.4 Growth curve of Bacillus subtilis ZJ20

2.7.2 酸耐受性结果

BacillussubtilisZJ20分别在pH值3.0、4.0、5.0的PBS中培养3 h后，存活率仍能保持在60%以上(图5)。

图5 不同pH下Bacillus subtilis ZJ20的耐受能力Fig.5 Tolerance of Bacillus subtilis ZJ20 under different pH

2.7.3 耐胆盐能力结果

BacillussubtilisZJ20在1、2、3 g/L牛胆盐的LB液体培养基中3 h存活率分别为91.56%、77.35%、68.12%(图6)。

图6 不同胆盐浓度下Bacillus subtilis ZJ20的耐受能力Fig.6 Tolerance of Bacillus subtilis ZJ20 under different bile salt concentrations

2.7.4 胃液耐受结果

BacillussubtilisZJ20在人工胃液中作用3 h后，活菌数从0 h的6.54×108CFU/mL下降至4.08×108CFU/mL，存活率保持在62.39%以上，说明该菌株能够耐受胃肠道环境并保持一定活性。

2.7.5 肠液耐受结果

BacillussubtilisZJ20在人工肠液中作用后，活菌数从0 h的7.98×108CFU/mL下降至5.36×108CFU/mL，存活率保持在67.17%以上。将本试验结果与刘晓燕等[17]研究的枯草芽孢杆菌WH1抗逆性试验结果对比，发现本试验菌株耐酸、耐胆盐能力高于WH1，而耐人工胃液能力稍低于WH1。

2.7.6 抑菌能力结果

通过牛津杯平板法对BacillussubtilisZJ20进行抑菌能力检测，结果表明对3株指示菌株均有抑菌效果，且抑菌圈平均直径在15 mm以上，对鼠伤寒沙门氏菌抑菌效果最好，抑菌圈直径达18.36 mm，大肠杆菌的抑菌圈为16.32 mm，金黄色葡萄球菌的抑菌圈为15.75 mm。

3 讨论

发霉饲料原料中的微生物长期处于与黄曲霉毒素共生存中，形成相互制约、相互依赖的微生物系统，长期被霉菌毒素污染的饲料中极可能存在能降解霉菌毒素的菌株[18]。本试验以霉变的饲料为样品，以安全的香豆素代AFB1标准品为唯一碳源进行AFB1降解菌的筛选，避免了与AFB1过多接触产生危险，本实验ELISA复筛结果也证明以香豆素为基质筛选降解AFB1菌株是切实可行的。

利用芽孢杆菌降解AFB1的研究已有报道，袁远等[19]筛选的枯草芽孢杆菌对1 μg/mL的AFB1降解率为68.39%。本试验筛选的枯草芽孢杆菌对0.5 μg/mL AFB1的降解率为84.23%，与报道菌株降解率不同，一是与菌种不同有关；二是与菌株本身的降解能力有关；三是与菌株的降解机制有关，一般依靠菌株吸附降解能力有限，而依靠菌株代谢产生降解酶则效率较高；四是与菌株培养条件有关，如培养时间、温度、pH值。所以要想得到对AFB1降解效果较好的菌株，必须综合考虑以上因素。

根据人和动物胃肠道特性，只有能够耐受较强酸性和胆盐环境的益生菌才能在胃肠道中存活并发挥其有益的作用。课题接下来实验设计是研究AFB1降解菌对肉鸡不同阶段生长性能的影响，所以有必要研究菌株的抗逆性和抑菌性。耐酸试验中，筛选的AFB1降解菌能够耐受通常情况下胃中酸度，说明可通过胃达到肠道，这为其作为脱毒剂发挥益生性能起到了先决作用。生长曲线显示该菌株能够利用营养成分快速繁殖，符合益生菌的基本特点。人和动物肠道菌群复杂多样，除定植有益微生物外，大量有害菌也在肠道中存在，进入动物肠道的有益微生物若要较好的发挥功能必须要抵抗有害菌的抑制作用[20]。本试验中，BacillussubtilisZJ20菌株上清液对以金黄色葡萄球菌为代表的革兰氏阳性菌和以大肠杆菌为代表的革兰氏阴性菌都具良好的抑菌效果，说明该菌可以抵抗动物肠道有害菌的不利影响而发挥正常的生理功能。

4 结论

本研究筛选得到1株对AFB1降解率为84.23%的枯草芽孢杆菌，还未对菌株安全性进行分析，接下来应进行动物急性毒性实验，确定菌株安全性。该菌株未来可能联合玉米赤霉烯酮、呕吐毒素等降解菌制成饲料脱霉剂或动物解毒剂。大量菌株因不能耐受胆盐等条件在畜牧生产中应用受阻，筛选抗逆性强的微生物在生产中尤为关键，本实验菌株对酸、胆盐、胃肠液等环境具有耐受性，符合制作微生态制剂的指标。该菌对常见病原菌具有抑菌性，作为饲料添加剂还能降低致病菌对动物的损害，有效减少大肠杆菌等引起的腹泻等疾病。总之该菌是作为AFB1生物降解的有效菌株之一，也是作为活菌饲料添加剂降低饲料中AFB1的良好选择。